Summary
حقن داخل الصفاق نظهر في الزرد الكبار. نحن نستخدم 10 microsyringe NanoFil ميكرولتر التي تسيطر عليها وحدة تحكم Micro4 UltraMicroPump والثالث. هذه التظاهرة يتضمن استخدام الماء البارد كمخدر.
Abstract
إن الطريقة المناسبة لمعالجة كيميائيا الزرد هي لتعريف كاشف في خزان المياه ، حيث سيتم تناوله من الأسماك. ومع ذلك ، هذا الأسلوب يجعل من الصعب معرفة كم هو كاشف أو استيعابها في تناول الأسماك. قد يكون هناك بعض الأسئلة التجريبية ، وبخاصة تلك المتعلقة بدراسات التمثيل الغذائي ، من خلال تقديم الأفضل تناول كمية محددة لكل الأسماك ، وعلى أساس الوزن. هنا نقدم أسلوبا للحقن (IP) داخل الصفاق في الزرد الكبار. الحقن في تجويف البطن ، والخلفي للحزام الحوض. ويتم تكييف هذا الإجراء من الأساليب المستخدمة للحصول على أكبر البيطرية الأسماك. أنها آمنة ، كما لاحظنا وفيات صفر. بالإضافة إلى ذلك ، شهدنا نزيف في موقع الحقن في 5 فقط من أصل 127 من الحقن ، وفي كل تلك الحالات كان ينزف ودائم وجيزة عدة ثوان ، وكمية الدم المفقود كان صغيرا. مع نجاح هذا الإجراء يتطلب التعامل مع طيف من الأسماك من خلال خطوات عدة منها الصوم ، وزنها ، والتخدير ، والحقن ، والانتعاش. الاحتياطات اللازمة للحد من التوتر في جميع أنحاء الداخلي. احتياطات لدينا تشمل استخدام وحدة تخزين صغيرة وحقن ابرة 35G. نستخدم كورتلاند محلول الملح والسيارة ، التي هي متوازنة osmotically للأسماك المياه العذبة. المحافظة على تهوية الخياشيم أثناء إجراء الحقن عن طريق جلب أول طائرة الأسماك في التخدير الجراحي ، والذي يسمح حركات الوصاد بطيئة ، والثانية ، وذلك بعقد السمك في حوض داخل اسفنجة مشبعة بالماء خلال الحقن نفسها. نحن لشرح فائدة الحقن الملكية الفكرية عن طريق حقن الجلوكوز ورصد ارتفاع في مستوى السكر في الدم وعودتها إلى وضعها الطبيعي لاحقا. كما هو معروف لزيادة الضغط السكر في الدم في الأسماك مكتملة العظام ، قارنا مستويات السكر في الدم لدى البالغين السيارة وعدم حقن حقن وتبين أن هذا الإجراء لا يؤدي إلى حدوث ارتفاع ملحوظ في مستوى السكر في الدم.
Protocol
1. التحضيرات قبل الحقن
- سريع الأسماك على الأقل قبل 24 ساعة من الحقن. وهذا تفريغ الأمعاء لمبة (المعدة) المحتويات. بروتوكول الصوم الأساسية لنقل الأسماك والكثافة في وضعها الطبيعي ، إلى خزان نظيفة ، ثم احبس الغذاء. على المدى الطويل يتطلب الصوم ظروف أكثر صرامة (على سبيل المثال ، لإجراء دراسات السكر في الدم) ، راجع اعتبارات إضافية في المناقشة.
- إعداد كورتلاند محلول الملح (بيري وآخرون ، 1984).
لحجم 100 مل ، حل في الماء المقطر التالية :
725 ملغ كلوريد الصوديوم (124.1 ملم)
38 ملغ بوكل (5.1 ملم)
41 ملغ نا 2 هبو 4 (2.9 ملم)
24 ملغ MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 ملم)
16 ملغ CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 ملم)
100 ملغ NaHCO 3 (11.9 ملم)
4 ز بوفيدون (PVP) (4 ٪)
1000 وحدة هيبارين USP
التصفية ، تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. - تحضير المجهر.
- تغطية قاعدة المجهر مع غلاف بلاستيكي لحمايتها في حالة انسكاب.
- وضع منشفة ورقية على رأس غلاف بلاستيكي. سوف يجلس على طاولة العمليات الجراحية على رأس منشفة ورقية.
- قبل ضبط التركيز عن طريق عرض الجدول الجراحية ، والتركيز على الاسفنجة.
- وزن السمكة.
- ملء كوب 500 مل حوالي 1 / 3 كامل مع مرفق المياه الأسماك.
- الفارغة التوازن.
- جمع السمك باستخدام الشباك. الفتيل المياه الزائدة بعيدا عن المرمى والأسماك اللمس لفترة وجيزة الصافي على مناشف ورقية. نقل الأسماك إلى الدورق.
- وزن السمكة.
- نقل الأسماك إلى خزان نظيفة.
- نقل كل الأسماك وزنه إلى خزان تلقاء نفسها وصفت.
- حساب حجم حقن لكل الأسماك على أساس وزن الأسماك.
- إعداد الحقنة وما يتصل بها من معدات الحقن. للحقن ، نوصي 35G إبرة الصلب مشطوف و10 microsyringe NanoFil ميكرولتر. تحضير حقنة NanoFil وأنابيب silflex باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ومن المهم لإزالة أي فقاعات من المحاقن والأنابيب. بعد ملء المحقنة والأنابيب ، وتركيب حقنة على المضخة ، وبرنامج لحقن حجم السمك أولا.
- إعداد جدول الجراحية.
- قطع الاسفنج اللين (مثل # D - L800 ، Jaece صناعات) بحيث يكون حوالي 20 ملم في الارتفاع. على وجه مسطح ، وجعل خفض هذا هو 10-15 ملم عميقة. هذا الخفض هو الحوض الصغير الذي سوف يعقد في السمك للحقن.
- تعيين الاسفنج في طبق بتري 60 مم.
- تعيين طبق بيتري مع الاسفنج الى غطاء ماصة مناسبة الحجم المربع تلميح. غطاء يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لاحتواء المياه للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الاسفنج ، ولكن يجب أن يكون كافيا لضحلة لا تحصل في الطريق. نستخدم غطاء من مربع تلميح P200 أن 11.4 سم الطول × 7،7 سم عرض × 1.5 سم دال
- إعداد مخدر.
- جعل باستخدام مكعبات الثلج المجروش مصنوعة من مرفق المياه الأسماك.
- ملء دلو الثلج النظيف مع الثلج المجروش.
- وضعت على طاولة العمليات الجراحية في وعاء كبير ، مثل 2.4 لتر Rubbermaid حاوية تخزين المواد الغذائية.
- صب بعض الماء مرفق (الحارة) في وعاء الخارجي وجدول الجراحية. الحفاظ على احتياطي من الماء الدافئ منشأة مجاورة.
- وضع ميزان الحرارة في وعاء الخارجي.
2. التخدير وحقن والاسترداد
- مكان الحاوية مخدر الخارجي بالاضافة الى طاولة مجاورة لجراحي المجهر. ودلو من رقائق الجليد القريبة.
- جعل درجة حرارة المياه الى 17 درجة مئوية بإضافة رقائق الثلج. هام : لا تذهب دون 17 درجة مئوية لهذه الخطوة.
- استخدام شبكة لنقل الأسماك إلى الحاوية الخارجي.
- إضافة رقائق الثلج ببطء إلى حاوية لتحقيق درجة الحرارة الى 12 درجة مئوية ، وعلى مدى عدة دقائق.
- مراقبة سلوك الأسماك : في 17 درجة مئوية أو أقل قليلا ، والسمك عادة سوف تنتشر زعانف الصدرية أفقيا ، اللحظات ، وقد الوصاد الحركات السريعة. كما تنخفض درجة الحرارة ، فإن الأسماك تسبح ببطء أكثر ، وأخيرا وقف السباحة. كما اقتربت الطائرة من التخدير الجراحي ، وسوف يلهث ووقف تحركات الوصاد سيتباطأ. السمكة مستعد لحقن عندما لا يتم الرد على معالجتها. بالنسبة لمعظم الأسماك ، و 12 درجة مئوية كافية. قد تتطلب أكبر الأسماك برودة واثالثا.
- كما وصلت درجة الحرارة المطلوبة (~ 12 درجة مئوية أو أكثر برودة) ، اضغط على الإسفنج لتشبع بها.
- إبقاء أصابعك في الماء بارد جدا بما فيه الكفاية أنها لن الاحماء الأسماك وإخراجه من التخدير خلال المناولة.
- مع الأصابع الباردة ، ونقل بلطف الأسماك إلى الحضيض من الاسفنج. موقف الأسماك مع البطن والخياشيم لتصل في الحوض الصغير.
- نقل بسرعة إلى طاولة الجراحة المرحلة المجهر.
- العمل بسرعة ، وإدراج بعناية الإبرة في المنتصف بين زعانف الحوض. وينبغي أن الإبرة نقطة cranially ويمكن إدراج أقرب إلى حزام الحوض بدلا من فتحة الشرج. يجب أن تكون قادرا على الشعور عندما الإبرة عميق لجدار الجسم. حقن حجم المناسبة وسحب الإبرة.
- بعد الحقن ، ونقل على الفور الأسماك مرة أخرى إلى المياه الدافئة في (~ 28،5 درجة مئوية) خزان للانتعاش من خلال اصدار السمك من الاسفنج على مياه الصهاريج.
نصيحة : إذا كان السمك لا يبدأ السباحة على الفور ، تساعده على استعادة عافيته بحلول دوامات المياه برفق نحو الخياشيم. - التحقق من الإبرة. أحيانا قد يكون تعلق على نطاق ويجب إزالتها قبل الحقن المقبل.
- لحقن لاحقة ، واستخدام المياه الدافئة منشأة لجلب الماء درجة حرارة الغرفة مخدر ما يصل الى 17 درجة مئوية قبل إدخال الأسماك المقبل.
3. ممثل النتائج :
الشكل 1. الممثل النتائج التالية حقن داخل الصفاق من الجلوكوز مغ / ز 0.5 أو السيارة. وقد صام السمك لمدة 72 ساعة قبل عملية الحقن. المحور س يبين الوقت ، بعد الحقن. يعني ± SEM.
Discussion
حقن داخل الصفاق ينطوي على خمس خطوات : الصيام ، وزنها ، والتخدير ، والحقن ، والانتعاش. من أجل كل خطوة هناك أفضل الممارسات التي يمكن أن تضمن النجاح. النجاح يتضمن المريض الأسماك صحية ، فضلا عن تحقيق نتائج جيدة التجريبية.
الصوم : يجب أن يكون سريع لمدة 24 ساعة فارغة لمبة المعوية. يتم أخذ هذه الممارسة من الأدب الأسماك البيطرية (على سبيل المثال ، بني عام 1993). وتناقش الاعتبارات الصيام إضافية أدناه.
على المدى الطويل الصوم : لقد وجدنا أن هناك حاجة إلى سريع لمدة 72 ساعة لخفض نسبة السكر في الدم إلى مستوى خط الأساس قبل الحقن (ايمز وآخرون ، 2010). وقد وجدنا أيضا أن للدراسات الجلوكوز وهناك العديد من الإجراءات التي يلزم اتخاذها لضمان صام السمك بشكل صحيح. تبدأ دبابة النظيفة (أي حطام على الجزء السفلي). وينبغي أن تكون الدبابات حاليا ، وصفت بوضوح بوصفها "الصوم" ، وفي المكان الذي حماسة العاملين في مجال الرعاية الأسماك ولن إطعامهم. تقييم البيئة الخارجية للدبابات واتخاذ خطوات لمنع الأسماك من يجري التشديد على من الاضطرابات ، كما هو معروف الضغط لرفع مستوى السكر في الدم (تشافين ويونغ ، 1970 ؛. Groff وآخرون ، 1999). على سبيل المثال ، كان لدينا تجربة في الصوم الذي تدير إذاعية يومية على مقاعد البدلاء الذي عقد الدبابات الأسماك. وجدنا أن مستوى السكر في الدم كانت مرتفعة بشكل غير عادي وخلصت إلى أنه تم التشديد على الأسماك من الاهتزازات. آخر الضغوطات والازدحام. ينبغي أن تظل الأسماك في مناطق ذات كثافة الذي يتوافق مع الممارسات الجيدة تربية الأسماك. للتوصيات ، انظر العلامة التجارية وآخرون. (2002) وWesterfield (1995). لقد كان لدينا نتائج جيدة الصيام أسماكنا في كثافة 10-12 الأسماك في خزان 9 لتر (مع 3 طبقات من الرخام تناول بعضا من هذه الكميات). يفصل بين الجنسين قد يسبب التوتر ، لذلك نحن ننصح الحفاظ على السكان مختلط الجنس أثناء الصيام. هذا يعني أنه يمكن وضع البيض ، والبيض يجب أن يتم عزلها بحيث لا يؤكل. وهناك طريقة بسيطة لعزل البيض هو لتغطية الجزء السفلي مع دبابات 2-3 طبقات من الرخام. جودة المياه من الضروري الحفاظ على طريق إزالة النفايات والبيض وبالاستعاضة عن 10-15 ٪ من مياه الصهاريج ، يوميا. لإزالة البيض والنفايات ، وشفط تعمل بشكل جيد.
يزن : عندما تزن السمكة التي لم يتم تخدير ، وينبغي الحرص على تقليل نقل المياه من الشبكة في الكأس ، لضمان دقة وزنها. إذا نشف الشباك (مع السمك) على المناشف الورقية ، ويمكن إزالة معظم المياه الزائدة ، ويمكن قياس الوزن بدقة. قد يكون من الأسهل لتخدير الأسماك قبل وزنها ، لكننا لم تختبر الآثار المحتملة للالتخدير سمكة مرتين في يوم واحد. لقد اختبرنا أسلوبنا التي تزن السمكة الأولى مع المعاوضة / النشاف الأسلوب ثم إعادة الأسماك وزنها بعد ان تم تخديره ، ونشف بلطف الجافة. وجدنا هناك فرق كبير في الوزن بين أساليب (P = 0.7927 ، اختبار t). بالإضافة إلى ذلك ، نحن اختبار ما إذا كانت هذه المعاوضة / النشاف جلوكوز الدم الأسلوب المتضررة ، بالمقارنة مع مجرد نقل الأسماك إلى الدورق بمجرد احرز عليه (أي النشاف). وجدنا أي اختلاف كبير في مستوى السكر في الدم بين طرق نقل اثنين (P = 0.2241 ، اختبار t).
التخدير : التخدير الكيميائية قد تكون مناسبة لكثير من الدراسات. هنا قد أثبتنا المياه الباردة التخدير كبديل ، وذلك لأن العديد من التخدير (بما في ذلك tricaine/MS-222 (براون ، 1993)) ، ورفع مستوى السكر في الدم. في الدراسات السابقة ، ونحن مصممون ان المياه الباردة لا تثير السكر في الدم في الزرد (ايمز وآخرون ، 2010).
للتخدير الماء البارد ، ينبغي انخفضت درجة الحرارة ببطء. معدل الانخفاض ويبدو أن تعتمد على حجم السمك ، مع الأسماك الصغيرة تسير تحت أسرع من أكبر الأسماك. بعد الحقن ، قد نلاحظ أن الأسماك يتعافى ببطء شديد من مخدر (أنظر أدناه). وهذا يمكن أن يؤدي إما عند درجة حرارة منخفضة جدا تبدأ ، أو عندما انخفضت درجة الحرارة بشكل سريع جدا. درجة حرارة منخفضة جدا تبدأ إذا كان ينحني عند الدخول أفقيا السمك في الماء. إذا كانت درجة الحرارة ابتداء هو الصحيح ، فإن الأسماك الحفاظ على توازنه في البداية. فإنه سيتم تدوير الزعانف الصدرية والخمسين لوضع أفقي ، اللحظات ، وقد الوصاد الحركات السريعة. عادة ، فإنه السباحة. مع انخفاض درجات الحرارة ، فإن حركات الانخفاض والأسماك سوف تفقد التوازن. يتم التوصل الى طائرة من التخدير الجراحي عندما يمكن معالجة الأسماك دون رد فعل. للحفاظ على الأسماك الجراحية تحت التخدير ، ويجب أن تكون أصابعك الباردة ، وحتى تبقى منهم في الماء قبل تناول الأسماك. ويجب أيضا أن تبقى الاسفنجة الباردة في نفس درجة حرارة المياه المستخدمة للالتخدير السمك. من المهم أن تشبع الاسفنجة بالماء الذي sufficiently الباردة مرة واحدة للحفاظ على تخدير يوضع السمك على ذلك.
الحقن : الحقن قبل التعهد ، قد تحتاج إلى تشريح واحدة على الأقل للحصول على السمك الشعور سمك جدار الجسم. وهذا يمكن أن تساعدك على القاضي مدى احتياجات لادخال ابرة لدخول تجويف البطن. بالإضافة إلى ذلك ، عند إدراج الإبرة ، يمكنك أن تشعر جدار الجسم "تعطي" عندما يدخل إبرة في تجويف البطن. خلال الحقن ، واتخاذ الخطوات اللازمة لإبقاء المريض سعيدا. تأكد من الإسفنج مشبعة بالماء البارد في درجة الحرارة الصحيحة لمنع الأسماك من خلال إحياء الحقن. اسفنجة مشبعة جيدة وميسرة مهم لتقليل الأضرار التي لحقت المقاييس والمخاط الذي يغطي الجلد. اسفنجة مشبعة جيدا المهم أيضا من أجل الحفاظ على الخياشيم الهوائية. نحن نوصي بشدة الاسفنجة رغوة الواردة أسماؤهم أدناه تحت المواد. أخيرا ، وبمجرد أن يتم تخدير الأسماك ، والعمل بسرعة لتقليل الوقت الذي الأسماك تحت.
الانتعاش : السمكة ينبغي على التعافي من التخدير تقريبا عند دخول خزان المياه الدافئة. إذا كان السمك لا يبدأ السباحة على الفور ، بلطف عباب الماء نحو الخياشيم لسرعة الانتعاش. إذا كان الانتعاش بطيئا ، ثم ذهب الأسماك تحت بسرعة كبيرة جدا ويجب عليك ضبط الإجراء التخدير بشكل مناسب. ويناقش الأسباب المحتملة من الانتعاش البطيء تحت التخدير.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة عن مرض السكري الأحداث منحة مؤسسة البحوث 5-2007-97 (لVEP) ، عن طريق المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى المنح R01DK064973 (لVEP) ، R01DK48494 (لLHP) ، T32DK07074 (دعم SCE) ، K01DK083552 (لMDK) ، وP60DK20595 لجامعة شيكاغو أبحاث السكري ومركز التدريب. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للجوائز كبيرة أو في المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
