Summary
我们证明到成年斑马鱼的腹腔注射。我们使用10μLNanoFil microsyringe由一个Micro4控制器和UltraMicroPump第三控制。此演示包括作为麻醉剂使用的冷水。
Abstract
化学治疗斑马鱼的一个方便的方法是引入水箱水，它会采取鱼试剂。但是，这种方法使人们难以知道的试剂吸收或每鱼。一些实验性的问题，特别是那些与代谢研究，可能会得到更好的解决提供了一个定义每条鱼的数量，重量。在这里，我们提出了一个腹腔（IP）注射到成年斑马鱼的方法。注射到腹腔，骨盆带后。此过程是改编自兽医的方法，用于更大的鱼。它是安全的，正如我们所观察到的零死亡率。此外，我们已经看到在只有5 127注射的注射部位出血，并在这些情况下，每年的出血是短暂的，持续几秒钟的时间，失血量小。这个过程的成功，需要通过几个步骤，包括禁食鱼温柔处理，称重，anesthetizing，注射和恢复。需要注意事项，以尽量减少在整个过程中的应力。我们的预防措施，包括使用一个小的注射量和35G针。我们使用的车辆，这是渗透平衡淡水鱼科特兰盐溶液。首先把手术的麻醉平面，它允许缓慢的鳃盖运动的鱼鳃曝气保持在注射过程，和第二，通过控股处于低谷的鱼在水饱和的海绵，在注射本身。我们通过注射葡萄糖和监测在血糖升高，随后恢复正常的IP注射的效用。由于压力是已知会增加血糖骨鱼，我们比较车辆注射和非注射的成年人血糖水平，并显示该程序不会导致血糖显着上升。
Protocol
1。注射前准备工作
- 快速的鱼至少24小时前注射。这将空肠道灯泡（胃）的内容。基本空腹协议转让的鱼，在他们的正常密度，一个干净的坦克，然后扣的食物。对于较长期的空腹，需要更严格的条件下（如血糖研究），看到讨论的其他因素。
- 准备盐溶液科特兰（Perry 等 ，1984）。
对于一个100毫升的量，溶于蒸馏水中以下内容：
725毫克盐（124.1毫米）
38毫克氯化钾（5.1毫米）
41毫克钠2 HPO 4（2.9毫米）
24毫克硫酸镁4∙7H 2 O（1.9毫米）
16毫克氯化钙2∙2H 2 O（1.4毫米）
100毫克碳酸氢钠3（11.9毫米）
4克聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（4％）
千药典单位肝素
过滤，消毒，并保存在4 ° C。 - 准备在显微镜。
- 盖保鲜膜在泄漏的情况下保护显微镜的基础。
- 把保鲜膜的顶部纸巾。坐在纸巾上手术台。
- 预调整的重点，通过观看手术表，并专注于海绵。
- 称取鱼。
- 填写一个500 mL烧杯中约1 / 3充满鱼设施水。
- 皮的平衡。
- 使用网收集的鱼。威克多余的水远离简单地涂抹在纸巾上的净净鱼。鱼转移到烧杯中。
- 称取鱼。
- 鱼转移到一个干净的坦克。
- 每个重达鱼转移到自己的标记坦克。
- 计算的注射量为鱼体重的每条鱼。
- 准备的注射器和相关的注射设备。注射用，我们建议一个35G斜角钢针和10μLNanoFil microsyringe。准备NanoFil注射器制造商的指示和silflex油管。重要的是要删除任何气泡从注射器和管。灌装注射器和油管后，装入注射器泵上的，并计划第一条鱼的注射量。
- 准备手术的表。
- 切柔软的海绵（如＃L800 - D Jaece工业），因此，它是在高度约20毫米。在平坦的脸，作出削减10-15毫米深。这种切割是注射的鱼槽，将举行。
- 设置成60毫米培养皿的海绵。
- 设置成一个适当大小的枪头箱盖海绵的培养皿。盖子必须大到足以容纳的水，以帮助保持海绵温度，但它应该是足够浅的方式获得。我们使用从P200的提示框是11.4厘米长x 7.7厘米宽x 1.5厘米的盖子D.
- 准备麻醉剂。
- 请使用鱼设施水制成的多维数据集的碎冰。
- 碎冰填充清洁冰桶。
- 放入一个更大的容器，如一个2.4升Rubbermaid的食物储存容器的手术台。
- 倒入一些设施水（温）外部容器和手术台。附近保持温暖设施，水的储备。
- 外部容器放入一个温度计。
2。麻醉，注射和恢复
- 将麻醉的外层容器加手术台旁显微镜。有冰块的桶附近。
- 把水的温度下降到17℃加入冰块。重要提示：不要低于17 ° C这一步。
- 使用净鱼转移到外部容器。
- 慢慢加入冰块的容器，把温度降低到12℃，超过几分钟的过程中。
- 监视器鱼的行为：在17 ° C或略低，鱼通常会传播其胸鳍水平，全球航空安全计划，并具有快速的鳃盖运动。随着气温下降，鱼会游泳更慢，最后停止游泳。由于手术的麻醉平面接触，喘气将停止，鳃盖运动将放缓。这种鱼是准备注射时没有反应处理。对于大多数鱼，12 ° C就足够了。更大的鱼可能需要更冷的WA之三。
- 由于所需的温度达到饱和的海绵（〜12 ° C或更低），按。
- 保持你的手指在冷水足以使他们不会热身鱼和带来的麻醉处理过程中。
- 用冷的手指，轻轻的鱼转移到槽的海绵。腹部和槽鳃鱼的位置。
- 快速传输的手术台，在显微镜阶段。
- 工作迅速，小心地插入针腹鳍之间的中线。针指向颅插入肛门比接近骨盆带。你应该能感觉到，当针深体壁。注入适当的数量和撤出针。
- 注射后，立即将鱼放回温水（〜28.5℃）回收罐释放出的鱼在鱼缸水的海绵。
提示：如果鱼没有立即开始游泳，帮助它恢复对鳃的水轻轻摇动。 - 检查针。偶尔可连接规模和未来注射前应删除。
- 对于随后的注射，用温水设施水，使麻醉室水温高达17℃前引入未来的鱼。
3。代表性的成果：
图1。代表性的结果，下面的腹腔注射0.5毫克/克葡萄糖或车辆。注射前72小时禁食鱼。 X轴显示时间，注射后。平均± SEM。
Discussion
腹腔注射包括五个步骤：禁食，称重，麻醉，注射，和恢复。对于每个步骤，有最好的做法，可以确保成功。成功包括健康的鱼的病人，以及良好的实验结果。
空腹：24小时快速清空肠道灯泡。这种做法是采取从鱼兽医文献（例如，1993年布朗）。附加空腹考虑下面讨论。
较长期禁食：我们已经找到，需要72小时快速注射前降低血糖至基线水平（埃姆斯等 ，2010）。我们还发现，对葡萄糖的研究中，有几个程序，所需，以确保鱼停食正确。用干净的坦克（没有在底部的碎片）开始。坦克应该是离线的，清楚地标示为“空腹”，并在一个位置，热情的鱼医护人员将不能养活他们。评估坦克的外部环境，并采取措施防止鱼从干扰强调，强调的是已知的，以提高血糖（Chavin和杨，1970;。Groff的等 ，1999 ）。例如，我们有一个空腹的实验中，一台收音机，每天工作在板凳上，拿着鱼缸。我们发现，血糖异常高，并得出结论，鱼振动强调。另一种应激是人满为患。鱼应保持在好鱼的饲养方法，符合密度。有关建议，请参阅品牌等 。 （2002年）和韦斯特（1995年）。我们有良好的效果，空腹我们在9升的油箱（3层占用一些体积大理石）的密度在10-12鱼的鱼。两性分离，可能会造成压力，所以我们建议维持一个混合性的人口在快速。这意味着可以奠定鸡蛋，鸡蛋需要被隔离，使他们不会被吃掉。封存鸡蛋一个简单的方法来覆盖2-3层大理石罐底。需要通过去除鸡蛋和废物，每天更换水箱的水大约10-15％，保持水质。对于去除鸡蛋和浪费，虹吸效果很好。
称重：称重鱼类，不麻醉时，应小心放入烧杯中，以尽量减少净调水，以保证称量准确。如果纸巾吸干网（鱼），大部分多余的水可以被删除，并可以准确测量体重。称重前麻醉鱼可能会更容易，但我们没有一天两次鱼的麻醉可能造成的影响进行测试。我们有我们的技术测试，称重网/印迹方法，然后重新称重的鱼的鱼后，已麻醉，轻轻涂抹干。我们没有发现的方法之间的重量显着性差异（P = 0.7927，t检验）。此外，我们测试是否扣除/印迹方法比较简单的鱼转移到烧杯中，只要它是落网（无杂交）受影响的血糖。我们没有发现两者之间的传输方法在血糖水平的显着性差异（P = 0.2241，t检验）。
Anesthetizing：化学麻醉可能适用于许多研究。在这里，我们已经证明作为替代冷水麻醉，因为许多麻醉药（包括tricaine/MS-222（布朗，1993年）），提高血糖。在以前的研究中，我们有决心，冷水不提高血糖，在斑马鱼（ 埃姆斯等，2010） 。
冷水麻醉，温度应缓慢下降。减少的幅度似乎取决于鱼的大小，较小的鱼下速度比更大的鱼。注射后，您可能会发现，鱼是从麻醉中恢复速度太慢（见下文）。这可能会导致当起始温度太低，或当温度下降过快。起始温度过低，入水后，如果鱼的横向弯曲。如果起始温度是正确的，鱼最初将保持其平衡。它会旋转到水平位置的胸鳍，喘气，并具有快速的鳃盖运动。通常情况下，它会游泳。随着温度的降低，动作减少，鱼会失去平衡。手术的麻醉平面到达时，鱼可以处理没有反应。为了维持手术麻醉下的鱼，你的手指必须是冷的，所以他们在水中前处理鱼。海绵也必须保持在同一温度下用于麻醉的鱼水作为冷。重要的是要饱和与水的海绵，是sufficiently冷维持麻醉，一旦鱼放置到它。
注射液：进行注射前，您可能要解剖至少有一条鱼，体壁的厚度感。这可以帮助你判断多远针需要插入进入腹腔。此外，当您插入针，你可以感受到身体墙“给”，当针进入腹腔。注射期间，采取措施，使病人高兴。确保饱和的海绵是正确的温度冷水，以防止注射过程中复苏的鱼。尽量减少破坏的规模和粘液覆盖的皮肤是很重要的一个饱和和柔软的海绵。同样重要的是保持鳃通气良好的饱和的海绵。我们强烈建议下面列出根据材料的海绵。最后，一旦鱼被麻醉，迅速开展工作，以尽量减少鱼是下的时间。
恢复：鱼应该从麻醉中恢复过来，几乎进入了温暖的鱼缸水。如果鱼没有开始立即游泳，轻轻对鳃，加快恢复的漩涡水。如果复苏缓慢，然后鱼去下得太快，你应该适当调整麻醉过程。下麻醉缓慢复苏的可能原因进行了讨论。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持青少年糖尿病研究基金会授予5-2007-97（VEP），这项研究是由国家糖尿病，消化道和肾脏疾病研究所授予R01DK064973（VEP），R01DK48494（LHP），T32DK07074（支持标准煤），K01DK083552 （MDK），P60DK20595到芝加哥糖尿病研究和培训中心大学。内容完全是作者的责任，并不一定代表NIDDK或美国国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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