Summary
Tonen we intraperitoneale injectie in volwassen zebravissen. We maken gebruik van een 10 ul NanoFil injectiespuit bestuurd door een Micro4 controller en UltraMicroPump III. Deze demonstratie omvat het gebruik van koud water als een verdoving.
Abstract
Een handige methode voor het chemisch behandelen van zebravis is om het reagens te introduceren in de tank water, waar het zal worden genomen door de vis. Echter, deze methode maakt het moeilijk om te weten hoeveel reagens wordt geabsorbeerd of opgenomen per vis. Sommige experimentele vragen, met name die met betrekking tot metabolische studies, kunnen beter worden aangepakt door het leveren van een bepaalde hoeveelheid aan elke vis, op basis van gewicht. Hier presenteren we een methode voor intraperitoneale (IP) injectie in volwassen zebravissen. Injectie is in de buikholte, posterior aan de bekkengordel. Deze procedure is een bewerking van diergeneeskundige methoden die worden gebruikt voor de grotere vissen. Het is veilig, zoals we hebben gezien nul sterfte. Daarnaast hebben we gezien bloeden op de injectieplaats in slechts 5 van de 127 injecties, en in elk van die gevallen het bloeden was kort, van enkele seconden, en de hoeveelheid verloren bloed was klein. Succes met deze procedure vereist voorzichtige behandeling van de vissen door middel van verschillende stappen waaronder vasten, wegen, verlamming, injectie, en herstel. Voorzorgsmaatregelen nodig zijn om stress te minimaliseren tijdens de gehele procedure. Onze voorzorgsmaatregelen zijn onder meer met behulp van een kleine injectie volume en een 35G naald. We maken gebruik van Cortland zout-oplossing als het voertuig, die osmotisch evenwichtig is voor zoetwatervissen. Beluchting van de kieuwen wordt gehandhaafd tijdens de injectie procedure door eerst brengen van de vis in een chirurgische vlak van anesthesie, die langzame bewegingen operculum toelaat, en ten tweede, door te oordelen de vis in een trog in een met water verzadigde spons tijdens de injectie zelf. Tonen we het nut van IP-injectie door het injecteren van glucose en het toezicht op de stijging van de bloedsuikerspiegel en de daaropvolgende weer normaal. Als stress is bekend dat het bloedglucosegehalte in teleost vis te verhogen, vergelijken we de bloedsuikerspiegel in de auto-injectie en de niet-gespoten volwassenen en laten zien dat de procedure niet een aanzienlijke stijging van de bloedsuikerspiegel veroorzaken.
Protocol
1. Pre-injectie Voorbereidingen
- Snel de vis voor ten minste 24 uur voorafgaand aan de injectie. Dit zal het legen van de darm-lamp (maag) inhoud. De basis vasten protocol is om de vissen te dragen, op hun normale dichtheid, met een schone tank, dan onthouden eten. Voor de langere termijn vasten dat strengere voorwaarden vereist (bijv. voor bloedglucose studies), zie aanvullende overwegingen in de discussie.
- Bereid Cortland zoutoplossing (Perry et al.., 1984).
Voor een 100 ml volume, Los de volgende in gedistilleerd water:
725 mg NaCl (124,1 mM)
38 mg KCl (5,1 mM)
41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mm)
24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mm)
16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm)
100 mg NaHCO 3 (11,9 mM)
4 g polyvinylpyrrolidon (PVP) (4%)
1000 USP eenheden heparine
Filter, steriliseren en bewaren bij 4 ° C. - Bereid de microscoop.
- Bedek de microscoop voet met plasticfolie voor de bescherming in geval van lozingen.
- Plaats een papieren handdoek op de top van de plastic verpakking. De chirurgische tafel zal zitten op de top van de papieren handdoek.
- Pre-scherpstelling door het bekijken van de chirurgische tafel en zich te concentreren op de spons.
- Weeg de vis.
- Vul een bekerglas van 500 ml ongeveer 1 / 3 vol met vis faciliteit water.
- Tarra de balans.
- Verzamel de vis met behulp van een net. Wick overtollig water uit de buurt van het net en de vis door kort deppen het net op keukenpapier. Breng de vis aan de beker.
- Weeg de vis.
- Breng de vis op een schone tank.
- Breng elke vis gewogen om zijn eigen label tank.
- Bereken het injectievolume voor elke vis op basis van vis gewicht.
- Bereid de spuit en de bijbehorende injectiemateriaal. Voor injectie, adviseren wij een 35G afgeschuind stalen naald en een 10 ul NanoFil injectiespuit. Bereid de spuit en NanoFil silflex buizen volgens de instructies van de fabrikant. Het is belangrijk om eventuele luchtbellen uit de spuit en slangen. Na het vullen van de spuit en slangen, monteert u de spuit op de pomp, en het programma de injectie volume voor de eerste vis.
- Bereid de chirurgische tafel.
- Snijd een zachte spons (zoals # L800-D, Jaece Industries), zodat het is ongeveer 20 mm in de hoogte. Op het plat gezicht, een snit die is 10-15 mm diep. Deze snede is de trog dat de vissen zal houden voor injectie.
- Stel de spons in een 60 mm petrischaal.
- Zet de petrischaal met een spons in een voldoende omvang pipetpunt deksel. Het deksel moet groot genoeg zijn om water vast te houden om te helpen spons temperatuur te houden, maar het moet ondiep genoeg om niet in de weg. We maken gebruik van een deksel van een P200 tip box die is 11,4 cm L x 7,7 cm B x 1,5 cm D.
- Bereid de narcose.
- Maak gemalen ijs met behulp van blokjes gemaakt van vis faciliteit water.
- Vul een schone emmer ijs met het gemalen ijs.
- Doe de chirurgische tafel in een grotere container, zoals een 2.4 liter Rubbermaid voedsel opslag container.
- Giet wat faciliteit water (warm) in de buitenste container en de chirurgische tafel. Houd een reserve van warm water voorziening in de buurt.
- Leg een thermometer in de buitenste container.
2. Anesthesie, injectie en herstel
- Plaats de verdoving buitenste container plus chirurgische tafel naast de microscoop. De buurt is de emmer met ijs chips.
- Breng het water temperatuur tot 17 ° C door het toevoegen van ijs chips. Belangrijk: Ga niet onder 17 ° C voor deze stap.
- Gebruik een net om de vis naar de buitenste container.
- Voeg langzaam ijs chips om de container om de temperatuur omlaag te brengen tot 12 ° C, in de loop van enkele minuten.
- Monitor vis gedrag: Bij 17 ° C of iets lager, de vis zal typisch horizontaal gespreid zijn borstvinnen, snik, en hebben een snelle operculum bewegingen. Naarmate de temperatuur daalt, zullen de vissen zwemmen langzamer en eindelijk te stoppen met zwemmen. Als de chirurgische vlak van anesthesie is benaderd, zullen hijgend stoppen en operculum bewegingen zal vertragen. De vis is klaar voor injectie wanneer hij reageert niet op worden behandeld. Voor de meeste vissen, 12 ° C is voldoende. Grotere vissen kan verlangen kouder water.
- Als de gewenste temperatuur is bereikt (~ 12 ° C of kouder), drukt u op de spons om het te verzadigen.
- Houd uw vingers in het koude water voldoende, zodat ze niet zullen warm-up van de vis en breng het uit de verdoving tijdens de behandeling.
- Met koude vingers voorzichtig overdracht van de vis naar het dieptepunt van de spons. Plaats de vis met de buik omhoog en de kieuwen in de trog.
- Snel overbrengen van de chirurgische tafel om de microscoop podium.
- Snel te werken, zorgvuldig steek de naald in de middellijn tussen de buikvinnen. De naald moet craniaal punt en dichter bij de bekkengordel ingebracht dan aan de anus. U moet in staat zijn om te voelen wanneer de naald is diep om het lichaam muur. Injecteer de juiste volume en trek de naald.
- Na injectie, onmiddellijk weer over de vis aan zijn warm-water (~ 28,5 ° C) tank voor herstel door het vrijgeven van de vis uit de spons over de tank water.
Tip: Als de vis niet begint te zwemmen onmiddellijk, helpen te herstellen door voorzichtig schudden water naar de kieuwen. - Controleer de naald. Af en toe een schaal kan worden gemonteerd en moet worden verwijderd voordat de volgende injectie.
- Voor de volgende injecties, gebruik van warm water mogelijkheid om de narcose kamer temperatuur van het water terug te brengen tot 17 ° C alvorens de volgende vis.
3. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Representatieve resultaten na intraperitoneale injectie van 0,5 mg / g glucose of voertuig. Vissen waren gevast gedurende 72 uur voorafgaand aan de injectie. De x-as geeft de tijd, post-injectie. Gemiddelde ± SEM.
Discussion
Intraperitoneale injectie omvat vijf stappen: vasten, wegen, verlamming, injectie, en herstel. Voor elke stap zijn er best practices die kunnen zorgen voor succes. Succes bestaat uit een gezonde vissen patiënt als een goede experimentele resultaat.
Vasten: Een 24-uur snel moet legen van de darm lamp. Deze praktijk is afkomstig van de vis veterinaire literatuur (bijv. Brown 1993). Extra vasten overwegingen worden hieronder besproken.
Langere termijn vasten: We hebben vastgesteld dat een 72-uur vasten is nodig om de bloedglucose verlagen naar een basisniveau voor de injectie (Eames et al., 2010.). We hebben ook geconstateerd dat voor glucose studies zijn er verschillende procedures die nodig zijn om ervoor te zorgen dat de vissen goed zijn vasten. Begin met een schone tank (geen puin op de bodem). Tanks moeten worden offline, duidelijk gemarkeerd als 'vasten', en op een plaats waar enthousiaste vis verzorgend personeel zal niet voeden. Evalueer de externe omgeving van de tank en stappen ondernemen om de vis te voorkomen dat benadrukt van verstoringen, zoals stress is bekend dat de bloedglucose (Chavin en Young, 1970.; Groff et al., 1999) te verhogen. Bijvoorbeeld, hadden we een vasten experiment waarin een radio dagelijks werd gebruikt op de bank, dat hield de vis tanks. We vonden dat het bloed glucose was ongewoon hoog en concludeerde dat de vissen werden benadrukt door de trillingen. Een andere stressfactor is overbevolking. Vis moet worden bewaard bij een dichtheid die in overeenstemming is met goede vis veehouderijpraktijken. Voor aanbevelingen, zie Brand et al.. (2002) en Westerfield (1995). We hebben goede resultaten vasten onze vis bij een dichtheid van 10-12 vis in een 9 liter tank (met 3 lagen knikkers toegang tot een deel van dat volume). Het scheiden van de seksen kan stress veroorzaken, dus we raden het onderhouden van een mixed-sex bevolking tijdens het vasten. Dit betekent dat de eieren kunnen worden gelegd, en de eieren moeten worden afgezonderd, zodat ze niet worden opgegeten. Een eenvoudige manier om eieren afzonderen is om de tank onderkant met 2-3 lagen knikkers. De waterkwaliteit moet worden gehandhaafd door het verwijderen van eieren en afval en door de vervanging van ongeveer 10-15% van de tank water, per dag. Voor het verwijderen van eieren en afval, overhevelen werkt goed.
Wegen: Bij de weging van vis die niet verdoofd zijn, zorg moeten worden genomen zodat er minimaal water uit het net in het bekerglas, om nauwkeurig wegen te garanderen. Als het net (met vis) is uitgewist op papier handdoeken, kan het grootste deel van het overtollige water worden verwijderd, en het gewicht nauwkeurig kan worden gemeten. Het kan makkelijker zijn voor de vissen verdoven voor het wegen, maar we hebben niet getest de mogelijke effecten van de verlamming een vis twee keer op een dag. We hebben onze techniek getest door weging van de vis eerst met de netten / blotting methode en vervolgens opnieuw de vis weegt, nadat het is verdoofd, en voorzichtig drooggedept. We vonden geen significant verschil in gewicht tussen de methodes (P = 0.7927, t-test). Daarnaast hebben we getest of dit gaas / blotting methode beïnvloed bloedglucose, in vergelijking met alleen de overdracht van de vis aan de beker zodra het is gesaldeerd (geen blotting). We vonden geen significant verschil in het bloed glucose-niveau tussen de twee overdrachtsmethodes (P = 0.2241, t-test).
Verlamming: Chemische anesthesie kunnen geschikt zijn voor veel studies. Hier hebben we aangetoond koud water verdoving als een alternatief, omdat veel anesthetica (inclusief tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), verhogen bloedglucose. In eerdere studies hebben we vastgesteld dat koud water niet bloedglucose te verhogen in zebravis (Eames et al.., 2010).
Voor koud water anesthesie, dient de temperatuur langzaam worden verminderd. Het tempo van de daling lijkt af te hangen van de grootte van de vis, met kleinere vissen onder te gaan sneller dan de grotere vissen. Na de injectie, kan het zijn dat de vis is te langzaam herstelt van de narcose (zie hieronder). Dit kan ontstaan wanneer het begin-temperatuur te laag is, of wanneer de temperatuur te snel af. De start temperatuur is te laag als de vis buigt zijdelings bij het binnenkomen van het water. Als de begintemperatuur juist is, zal de vis in eerste instantie houden aan haar balans. Het zal draaien zijn borstvinnen naar een horizontale positie, snik, en hebben een snelle operculum bewegingen. Doorgaans zal het zwemmen. Naarmate de temperatuur daalt, zullen de bewegingen verminderen en de vis zal verliezen evenwicht. Een chirurgisch vlak van anesthesie is bereikt wanneer de vis kan worden behandeld zonder te reageren. Handhaving van de vis onder chirurgische anesthesie, moet uw vingers koud zijn, zodat deze vóór te houden in het water om het hanteren van de vis. De spons moet ook worden bewaard koud op dezelfde temperatuur als het water gebruikt voor verlamming van de vis. Het is belangrijk om te verzadigen de spons met water dat is sufficiently koud om narcose te onderhouden als de vis op de plaat legt.
Injectie: Voorafgaand aan de onderneming injecties, wilt u misschien om ten minste een vis ontleden om een gevoel van het lichaam van de wanddikte te krijgen. Dit kan u helpen om te beoordelen hoe ver de naald moet plaatsen om de buikholte te voeren. Bovendien, als je de naald, voel je het lichaam muur "geven" wanneer de naald komt in de buikholte. Tijdens de injectie, stappen ondernemen om de patiënt tevreden. Zorg ervoor dat de spons is verzadigd met de juiste temperatuur koud water om de vissen te voorkomen dat doen herleven tijdens de injectie. Een goed verzadigd en zachte spons is belangrijk voor het minimaliseren van schade aan de schubben en slijm bedekken van de huid. Een goed verzadigde spons is ook belangrijk voor het bijhouden van de kieuwen belucht. We raden het schuim spons hierna vermeld onder Materials. Tot slot, wanneer de vis is verdoofd, snel werken om de tijd dat de vis is onder te minimaliseren.
Herstel: De vissen moeten uit de narcose te herstellen vrijwel bij het betreden van het warme bak water. Als de vis niet begint te zwemmen onmiddellijk voorzichtig krul het water naar de kieuwen het herstel bespoedigen. Als het herstel is traag, dan is de vis onder ging te snel en je moet de anesthesie procedure juiste wijze aan te passen. De mogelijke oorzaken van langzaam herstel worden besproken onder verlamming.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Juvenile Diabetes Research Foundation te verlenen 5-2007-97 (tot VEP), door National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases beurzen R01DK064973 (tot VEP), R01DK48494 (tot LHP), T32DK07074 (ondersteunt SCE), K01DK083552 (naar MDK), en door P60DK20595 aan de Universiteit van Chicago Diabetes Research and Training Center. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIDDK of de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
