Summary
Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l'utilisation de l'eau froide comme anesthésique.
Abstract
Une méthode pratique pour traiter chimiquement le poisson-zèbre est d'introduire le réactif dans l'eau du réservoir, où il sera repris par les poissons. Cependant, cette méthode rend difficile de savoir combien de réactif est absorbé ou repris par poisson. Certaines questions expérimentales, en particulier ceux liés aux études métaboliques, peut-être mieux abordées par la livraison d'une quantité définie de chaque poisson, basée sur le poids. Nous présentons ici une méthode pour intrapéritonéale (IP) d'injection dans le poisson zèbre adulte. L'injection est dans la cavité abdominale, postérieur à la ceinture pelvienne. Cette procédure est adaptée de méthodes vétérinaires utilisés pour les grands poissons. Il est sûr, que nous avons observé une mortalité zéro. En outre, nous avons vu des saignements au site d'injection dans seulement 5 des 127 injections, et dans chacun de ces cas, le saignement a été brève, d'une durée de quelques secondes, et la quantité de sang perdu était petit. Succès de cette procédure nécessite une manipulation en douceur du poisson par plusieurs étapes dont le jeûne, la pesée, anesthésier, l'injection et la récupération. Des précautions sont nécessaires pour minimiser le stress tout au long de la procédure. Nos précautions en utilisant un volume d'injection de petites et une aiguille 35G. Nous utilisons une solution saline Cortland que le véhicule, qui est osmotiquement équilibrée pour les poissons d'eau douce. L'aération des branchies est maintenu durant la procédure d'injection par les première apportant le poisson dans un plan chirurgical de l'anesthésie, qui permet des mouvements lents opercule, et la seconde, en tenant le poisson dans une cuvette à l'intérieur d'une éponge saturée d'eau pendant l'injection elle-même. Nous démontrons l'utilité de l'injection IP en injectant du glucose et du suivi de la montée du niveau de glucose dans le sang et son retour ultérieur à la normale. Comme le stress est connu pour augmenter le glucose sanguin chez les poissons téléostéens, nous comparons les taux de glycémie chez les adultes des véhicules à injection et non injecté et montrent que la procédure ne cause pas une hausse significative de la glycémie.
Protocol
1. Les préparatifs pré-injection
- Rapide le poisson pendant au moins 24 heures avant l'injection. Cela vide le bulbe intestinale (estomac) contenu. Le protocole de jeûne de base est de transférer les poissons, à leur densité normale, à un réservoir propre, puis retenir la nourriture. Pour plus long terme le jeûne qui exige des conditions plus rigoureuses (par exemple, pour les études de glucose dans le sang), voir d'autres considérations dans la discussion.
- Préparer une solution saline Cortland (Perry et al., 1984).
Pour un volume de 100 ml, dissoudre dans l'eau distillée:
725 mg de NaCl (124,1 mM)
38 mg de KCl (5,1 mM)
41 mg de Na 2 HPO 4 (2,9 mM)
24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM)
16 mg de CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm)
100 mg de NaHCO 3 (11,9 mm)
4 g de polyvinylpyrrolidone (PVP) (4%)
1000 unités d'héparine USP
Filtre, stériliser et stocker à 4 ° C. - Préparer le microscope.
- Couvrez la base de microscope avec une pellicule de plastique pour la protection en cas de déversements.
- Mettez une serviette en papier sur le dessus de la pellicule de plastique. La table d'opération sera assis sur le haut de la serviette en papier.
- Pré-ajuster le focus en regardant la table d'opération et en se concentrant sur l'éponge.
- Peser le poisson.
- Remplir un bécher de 500 ml environ 1 / 3 avec de l'eau installation poissons.
- Tarer la balance.
- Recueillir les poissons à l'aide d'un filet. Mèche excès d'eau loin de la net et du poisson par une brève tamponnant sur le net sur des serviettes en papier. Transférer les poissons dans le bécher.
- Peser le poisson.
- Transférer les poissons dans un réservoir propre.
- Transfert chaque poisson pesé à son réservoir étiquetés propres.
- Calculer le volume d'injection pour chaque poisson en fonction du poids des poissons.
- Préparer la seringue et du matériel liés à l'injection. Pour l'injection, nous recommandons une aiguille 35G acier biseauté et une microseringue de 10 Nanofil ul. Préparer la seringue Nanofil et tubes Silflex suivant les instructions du fabricant. Il est important d'enlever toutes les bulles de la seringue et la tubulure. Après avoir rempli la seringue et le tube, monter la seringue sur la pompe, et le programme du volume d'injection pour le premier poisson.
- Préparer la table d'opération.
- Couper une éponge douce (tels que # L800-D, Jaece Industries) afin qu'il se trouve à environ 20 mm de hauteur. Sur le visage plat, faire une coupe qui est de 10-15 mm de profondeur. Cette coupe est le creux qui va tenir le poisson pour l'injection.
- Réglez l'éponge dans un plat de Pétri de 60 mm.
- Réglez la boîte de Pétri avec éponge dans un couvercle de dimensions adéquates et une pipette boîte de pointe. Le couvercle doit être assez grand pour contenir l'eau pour aider à maintenir la température de l'éponge, mais il devrait être assez peu profond pour ne pas obtenir de la manière. Nous utilisons un couvercle d'une boîte P200 pointe est de 11,4 cm L x 7,7 cm L x 1,5 cm D.
- Préparer l'anesthésie.
- Faire de la glace pilée à l'aide des cubes à partir de l'eau installation poissons.
- Remplissez un seau à glace nettoyer avec de la glace concassée.
- Mettez la table d'opération dans un grand récipient, tel qu'un conteneur de 2,4 litres de Rubbermaid entreposage des aliments.
- Versez de l'eau des installations (à chaud) dans le conteneur extérieur et la table d'opération. Gardez une réserve d'eau chaude installation à proximité.
- Mettez un thermomètre dans le conteneur extérieur.
2. Anesthésie par injection et récupération
- Placez le récipient anesthésie extérieur et table chirurgicale adjacent au microscope. Avez-seau de copeaux de glace à proximité.
- Amener la température de l'eau à 17 ° C en ajoutant des glaçons. Important: Ne pas descendre en dessous de 17 ° C pendant cette étape.
- Utilisez un filet de transférer le poisson sur le conteneur externe.
- Ajouter lentement morceaux de glace pour le conteneur pour abaisser la température à 12 ° C, au cours de plusieurs minutes.
- Surveiller le comportement des poissons: à 17 ° C ou légèrement plus bas, le poisson se propage généralement ses nageoires pectorales horizontalement, gasp, et avoir des mouvements opercule rapide. Comme la température baisse, les poissons nagent plus lentement et finalement arrêter la natation. Comme le plan chirurgical de l'anesthésie est approché, haletant s'arrête et mouvements opercule sera lente. Le poisson est prêt pour l'injection quand elle ne réagit pas à être manipulés. Pour la plupart des poissons, 12 ° C est suffisante. Les gros poissons peuvent exiger plus froides water.
- Comme la température souhaitée est atteinte (~ 12 ° C ou moins), appuyez sur l'éponge pour le saturer.
- Gardez vos doigts dans l'eau froide suffisamment pour qu'ils ne seront pas réchauffer le poisson et le faire sortir de l'anesthésie pendant la manipulation.
- Avec les doigts froids, doucement transférer les poissons à l'auge de l'éponge. Placez le poisson avec l'abdomen et les branchies dans l'auge.
- Transférez rapidement la table de chirurgie de la platine du microscope.
- En travaillant rapidement, soigneusement insérer l'aiguille dans la ligne médiane entre les nageoires pelviennes. L'aiguille doit pointer crânialement et être insérés près de la ceinture pelvienne que de l'anus. Vous devriez être capable de sentir lorsque l'aiguille est profond à la paroi du corps. Injecter le volume approprié et retirer l'aiguille.
- Après l'injection, transférer immédiatement le poisson de son eau chaude (~ 28,5 ° C) du réservoir pour la récupération en libérant le poisson de l'éponge sur l'eau du réservoir.
Astuce: Si le poisson ne commence pas nager immédiatement, l'aider à récupérer l'eau en remuant doucement vers les branchies. - Vérifiez l'aiguille. Parfois une échelle peut être attaché et doit être enlevé avant la prochaine injection.
- Pour les injections suivantes, l'utilisation d'eau chaude installation pour amener la température de l'eau anesthésie chambre arrière jusqu'à 17 ° C avant d'introduire le prochain poisson.
3. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Les résultats représentatifs après injection intrapéritonéale de 0,5 mg / g de glucose ou d'un véhicule. Les poissons ont été à jeun pendant 72 heures avant l'injection. L'axe des abscisses montre le temps, après l'injection. Moyenne ± SEM.
Discussion
L'injection intrapéritonéale comporte cinq étapes: le jeûne, la pesée, anesthésier, l'injection et la récupération. Pour chaque étape il ya les meilleures pratiques qui peuvent assurer le succès. Le succès comprend un patient poissons en bonne santé ainsi que d'un bon résultat expérimental.
Le jeûne: un jeûne de 24 heures devrait vider l'ampoule intestinale. Cette pratique est tiré de la littérature poissons vétérinaires (par exemple, Brown, 1993). D'autres considérations de jeûne sont discutés ci-dessous.
À plus long terme à jeun: Nous avons constaté qu'un jeûne de 72 heures est nécessaire pour diminuer la glycémie à un niveau de base avant l'injection (Eames et al, 2010).. Nous avons également constaté que pour des études de glucose il ya plusieurs procédures qui sont nécessaires pour s'assurer que les poissons sont mis à jeun correctement. Commencez avec un réservoir propre (pas de débris sur le fond). Les réservoirs doivent être déconnecté, clairement étiqueté comme «jeûne», et dans un endroit où enthousiastes personnel des soins de poisson ne sera pas les nourrir. Évaluer l'environnement externe de la cuve et prendre des mesures pour empêcher les poissons d'être stressés par des perturbations, comme le stress est connu pour augmenter la glycémie (Chavin et Young, 1970;. Groff et al, 1999). Par exemple, nous avons eu une expérience dans laquelle le jeûne d'une radio a été opéré quotidiennement sur le banc qui tenait les réservoirs de poissons. Nous avons constaté que la glycémie était anormalement élevé et a conclu que les poissons ont été soulignés par les vibrations. Un autre facteur de stress est la surpopulation. Les poissons devraient être maintenus à une densité conforme aux bonnes pratiques d'élevage des poissons. Pour les recommandations, voir Brand et al. (2002) et Westerfield (1995). Nous avons eu de bons résultats à jeun nos poissons à une densité de 10-12 poissons dans un réservoir de 9 litres (avec 3 couches de billes de prendre une partie de ce volume). La séparation des sexes peut causer du stress, nous recommandons de maintenir une population mixte de sexe pendant le jeûne. Cela signifie que les œufs peuvent être établies, et les œufs ont besoin d'être séquestré, afin qu'ils ne se mange pas. Un moyen simple pour séquestrer les oeufs est de couvrir le fond du réservoir avec 2-3 couches de billes. Qualité de l'eau doit être maintenu en retirant les oeufs et les déchets et en remplaçant environ 10-15% de l'eau du réservoir, tous les jours. Pour enlever les œufs et les déchets, le siphonnage fonctionne bien.
Pesée: Lors du pesage des poissons qui ne sont pas anesthésiés, les soins devraient être prises pour minimiser le transfert de l'eau du filet dans le bécher, afin d'assurer un pesage précis. Si le net (avec du poisson) est effacé sur du papier absorbant, la majorité de l'eau en excès peut être enlevé et le poids peut être mesurée avec précision. Il peut être plus facile d'anesthésier le poisson avant la pesée, mais nous n'avons pas testé les effets possibles d'anesthésier un poisson deux fois par jour. Nous avons testé notre technique en pesant le premier poisson avec le filet / buvard méthode et puis re-pesée du poisson après qu'il a été anesthésié, et doucement effacé sec. Nous n'avons trouvé aucune différence significative de poids entre les méthodes (P = 0,7927, test t). De plus, nous avons testé si ce filet / buvard glycémie méthode affectée, en comparaison avec tout simplement le transfert des poissons dans le bécher dès qu'il est pris au filet (pas de buvard). Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le niveau de glucose sanguin entre les deux méthodes de transfert (P = 0,2241, test t).
Anesthésiant: anesthésie chimique peut être adapté à de nombreuses études. Ici, nous avons démontré l'anesthésie de l'eau froide comme une alternative, parce anesthésiques beaucoup (y compris tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), augmenter la glycémie. Dans des études précédentes, nous avons déterminé que l'eau froide ne pose pas de glucose dans le sang chez le poisson zèbre (Eames et al., 2010).
Pour l'anesthésie de l'eau froide, la température doit être diminué lentement. Le taux de diminution semble dépendre de la taille du poisson, avec des poissons plus petits vont plus vite que dans les plus gros poissons. Après l'injection, vous pouvez observer que le poisson se remet trop lentement de l'anesthésie (voir ci-dessous). Cela peut entraîner lorsque soit la température de départ est trop faible, ou lorsque la température diminue trop rapidement. La température de départ est trop faible si les virages poissons latéralement en entrant dans l'eau. Si la température de départ est correct, le poisson va maintenir son équilibre initialement. Il va tourner ses nageoires pectorales en position horizontale, le souffle coupé, et avoir des mouvements opercule rapide. Typiquement, il nagera. Comme la température diminue, les mouvements de va diminuer et les poissons vont perdre l'équilibre. Un avion d'une anesthésie chirurgicale est atteint lorsque le poisson peut être manipulé sans réagir. Afin de maintenir le poisson sous anesthésie chirurgicale, vos doigts doivent être à froid, afin de les garder dans l'eau avant de manipuler le poisson. L'éponge doit également être conservés au froid à la même température que l'eau utilisée pour anesthésier les poissons. Il est important de saturer l'éponge avec de l'eau qui est sufficiently froide pour maintenir l'anesthésie une fois le poisson est placé sur elle.
Injection: Avant les injections entreprise, vous voudrez peut disséquer au moins un poisson pour avoir une idée de l'épaisseur de paroi du corps. Cela peut vous aider à juger à quel point l'aiguille doit insérer pour entrer dans la cavité abdominale. De plus, comme vous insérer l'aiguille, vous pouvez sentir la paroi du corps «donner» lorsque l'aiguille pénètre dans la cavité abdominale. Pendant l'injection, prendre des mesures pour garder le patient heureux. Assurez-vous que l'éponge est saturée avec de l'eau froide température correcte pour empêcher les poissons de revivre pendant l'injection. Une éponge bien saturées et douce est importante pour minimiser les dommages à l'échelle et le mucus qui couvre de la peau. Une éponge bien saturées est également important de garder les branchies aéré. Nous recommandons fortement l'éponge en mousse énumérés ci-dessous sous Matériaux. Enfin, une fois le poisson est anesthésié, travailler rapidement pour minimiser le temps que le poisson est moins.
Recouvrement: Le poisson doit se remettre de l'anesthésie presque à l'entrée du réservoir d'eau chaude. Si le poisson ne commence pas immédiatement la natation, agiter doucement l'eau vers les branchies pour accélérer la récupération. Si la récupération est lente, puis le poisson est allé trop vite, sous et vous devriez régler la procédure d'anesthésie appropriée. Les causes possibles de la lente reprise sont examinées sous anesthésiant.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Juvenile Diabetes Research Foundation accorde 5-2007-97 (au VEP), par l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales subventions R01DK064973 (au VEP), R01DK48494 (pour LHP), T32DK07074 (soutien SCE), K01DK083552 (pour MDK), et par P60DK20595 à l'Université de Chicago recherche sur le diabète et le Centre de Formation. Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'NIDDK ou le NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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