Summary
אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.
Abstract
שיטה נוחה כימית בטיפול דג הזברה היא להציג מגיב למים טנק, איפה זה יהיה תפוס על ידי הדגים. עם זאת, שיטה זו מקשה לדעת כמה מגיב נספג או נלקח לכל הדגים. כמה שאלות ניסיוניות, במיוחד אלה הקשורים מחקרים מטבוליים, ניתן לפנות טוב יותר על ידי מתן כמות מוגדרת דגים כל, בהתבסס על המשקל. כאן אנו מציגים שיטה הזרקה (IP) intraperitoneal לתוך דג הזברה מבוגר. הזרקה היא לתוך חלל הבטן, אחורי אל חגורת האגן. הליך זה מותאם משיטות וטרינרי המשמש דגים גדולים יותר. זה בטוח, כפי שכבר ציין התמותה אפס. בנוסף, ראינו דימום במקום ההזרקה ב 5 מתוך 127 זריקות בלבד, ובכל אחד מהמקרים האלה הדימום היה קצר, שנמשך מספר שניות, וכמות הדם שאבד היה קטן. הצלחה עם הליך זה דורש טיפול עדין של הדג באמצעות מספר צעדים, כולל צום, שקילה, זריקת הרדמה, התאוששות. אמצעי זהירות נדרשים כדי למזער את הלחץ לאורך כל ההליך. אמצעי הזהירות שלנו כוללים שימוש נפח הזרקה קטן מחט 35G. אנו משתמשים בפתרון Cortland מלח כמו הרכב, אשר מאוזנת אוסמוטי של דגי מים מתוקים. אוורור של הזימים נשמר במהלך ההליך הזרקת ידי הראשון להביא את הדג לתוך מטוס כירורגית של הרדמה, אשר מאפשר תנועות operculum איטית, ושנית, על ידי החזקת דגים שוקת בתוך ספוג מים רוויים במהלך ההזרקה עצמה. אנו מדגימים את כלי ה-IP של הזרקת ידי הזרקת גלוקוז ניטור עלייה ברמת הגלוקוז בדם ולחזור הבאים שלה למצב נורמלי. כאשר הלחץ ידוע להגדיל הגלוקוז בדם בדגים teleost, אנו משווים את רמות הגלוקוז בדם אצל מבוגרים, הרכב מוזרק ולא מוזרק ולהראות כי ההליך אינו גורם לעלייה משמעותית רמת הסוכר בדם.
Protocol
1. טרום הזרקת תכשירים
- Fast הדגים לפחות 24 שעות לפני הזריקה. זה יהיה לרוקן את המעיים (בטן) תוכן הנורה. פרוטוקול צום הבסיסי הוא להעביר את הדגים, בצפיפות הרגילה שלהם, כדי לנקות את הטנק, אז לחתול מזון. במשך הצום לטווח ארוך הדורש תנאים מחמירים יותר (למשל, ללימודי הגלוקוז בדם), ראה שיקולים נוספים בדיון.
- הכן פתרון Cortland מלח (פרי et al. 1984).
עבור נפח של 100 מ"ל, לפרק את הבאים מים מזוקקים:
725 מ"ג NaCl (124.1 mM)
38 מ"ג KCl (5.1 mM)
41 מ"ג Na 2 HPO 4 (2.9 mM)
24 מ"ג MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM)
16 מ"ג CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM)
100 מ"ג NaHCO 3 (11.9 mM)
4 גרם Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4%)
1,000 יחידות הפרין USP
סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. - הכן את המיקרוסקופ.
- מכסים את בסיס מיקרוסקופ בניילון נצמד להגנה במקרה של נזילות.
- לשים מגבת נייר על גבי עטיפת הפלסטיק. הטבלה כירורגית תשב על גבי מגבת נייר.
- טרום להתאים להתמקד ידי הצגת הטבלה כירורגית התמקדות הספוג.
- לשקול את הדגים.
- ממלאים כוס 500 מ"ל כ 1 / 3 מלא עם מתקן מים ודגים.
- טרה את האיזון.
- איסוף הדגים באמצעות הרשת. וויק עודפי המים מן הרשת ודגים על ידי לחיצה קצרה מספיגה נטו על מגבות נייר. מעבירים את הדג כוס.
- לשקול את הדגים.
- מעבירים את הדגים לאקווריום נקי.
- העברת כל הדגים שקל למכל שלו שכותרתו.
- חשב את נפח הזרקה לדגים זה מבוסס על משקל הדגים.
- הכן את המזרק וציוד הזרקת בנושא. עבור זריקה, אנו ממליצים מחט 35G פלדה משופעים ו microsyringe 10 NanoFil μl. הכן את המזרק NanoFil צינורות silflex הבאים הוראות היצרן. חשוב להסיר כל הבועות מן המזרק צינורות. לאחר מילוי במזרק צינורות, לעלות את המזרק על המשאבה, והתוכנית נפח הזרקה לדגים הראשונה.
- הכן את הטבלה כירורגית.
- גזור ספוג רך (כגון # L800-D, Jaece תעשיות), כך הוא כ 20 מ"מ גובה. על פניו שטוח, לעשות חתך כי הוא 10-15 מ"מ עמוק. לחתוך זוהי שוקת כי תקיים את הדג להזרקה.
- הגדר את הספוג לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.
- הגדר את צלחת פטרי עם ספוג לתוך מכסה מתאים בגודל קופסת פיפטה קצה. המכסה צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל מים מנת לשמור על חום ספוג, אבל זה צריך להיות רדוד מספיק כדי לא להפריע. אנו משתמשים המכסה מהקופסה P200 טיפ כי הוא 11.4 ס"מ אורך x 7.7 ס"מ רוחב X 1.5 ס"מ ד
- הכן את ההרדמה.
- בצע באמצעות קוביות קרח מרוסק עשוי מתקן מים ודגים.
- ממלאים דלי קרח נקי עם קרח כתוש.
- שים את השולחן כירורגית לתוך מיכל גדול כמו מיכל 2.4 ליטר Rubbermaid אחסון מזון.
- יוצקים מעט מים מתקן (חם) לתוך המיכל החיצוני ואת שולחן הניתוח. שמור מילואים של מתקן מים חמים בקרבת מקום.
- שים מדחום לתוך המיכל החיצוני.
2. , הזרקת הרדמה והתאוששות
- הנח את המיכל החיצוני הרדמה כירורגית פלוס שולחן סמוך המיקרוסקופ. האם את הדלי של שבבי קרח הסמוך.
- הביאו את טמפרטורת המים עד 17 ° C על ידי הוספת קוביות קרח. חשוב: אל תלך מתחת 17 ° C לצעד זה.
- השתמש נטו להעביר את הדגים למיכל החיצוני.
- לאט לאט להוסיף קוביות קרח כדי המיכל להביא את הטמפרטורה עד 12 מעלות צלזיוס, במשך מספר דקות.
- התנהגות צג דגים: בגיל 17 מעלות צלזיוס או מעט נמוך יותר, בדרך כלל הדג יתפשט סנפירי החזה שלה אופקית, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. כאשר הטמפרטורה יורדת, דגים ישחו יותר לאט ולבסוף להפסיק לשחות. כאשר מטוס של הרדמה כירורגית הוא התקרב, מתנשם יפסיק ותנועות operculum יואט. הדג מוכן להזרקה כאשר הוא אינו מגיב מטופל. במשך רוב הדגים, 12 ° C היא מספיקה. דגים גדולים יותר עשויים לדרוש wa קרter.
- כאשר הטמפרטורה הנדרשת היא הגיעה (~ 12 ° C או קר), לחץ על הספוג כדי להרוות את זה.
- שמור את האצבעות במים קרים דיים, כך שהם לא לחמם את הדגים ולהביא אותו מתוך הרדמה במהלך הטיפול.
- עם אצבעות קרות, בעדינות להעביר את הדגים לשוקת של הספוג. מקם את הדג עם הבטן מעלה את הזימים בשוקת.
- העבר במהירות את השולחן כירורגית לשלב מיקרוסקופ.
- עבודה במהירות, בזהירות להכניס את המחט לתוך קו האמצע בין סנפירי גחון. המחט צריכה נקודה cranially להיות מוכנס קרוב חגורת האגן מאשר בפי הטבעת. אתה אמור להיות מסוגל להרגיש כאשר המחט עמוק אל הקיר הגוף. להזריק את נפח המתאימה לשלוף את המחט.
- לאחר ההזרקה, מיד להעביר את הדג בחזרה למים חמים שלה (~ 28.5 ° C) טנק להתאוששות ידי שחרור דגים מהספוג מעל המים טנק.
עצה: אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, לסייע לה להתאושש על ידי בעדינות מתערבלים המים לכיוון הזימים. - בדוק את המחט. מדי פעם בקנה מידה ניתן יהיה לעקל, ויש להסירם לפני הזריקה הבאה.
- עבור זריקות לאחר מכן, להשתמש במתקן מים חמים כדי להביא את טמפרטורת המים הרדמה בחדר האחורי עד 17 ° C לפני מציגה את הדג הבא.
3. נציג תוצאות:
באיור 1. התוצאות הבאות נציג intraperitoneal הזרקה של גלוקוז מ"ג / גרם 0.5 או רכב. דגים הם צמו במשך 72 שעות לפני הזריקה. ציר X מראה, שלאחר זמן ההזרקה. ממוצע ± SEM.
Discussion
הזרקת intraperitoneal כרוכה בחמישה שלבים: בצום, שקילה, הרדמה, זריקה, והתאוששות. לכל שלב יש את שיטות העבודה המומלצות שיכול להבטיח הצלחה. הצלחה כוללת החולה דגים בריאים, כמו גם תוצאות הניסוי טוב.
צום: מהיר 24 שעות ביממה, צריך לרוקן את הנורה מעיים. נוהג זה נלקח מתוך הספרות דגים וטרינרי (למשל, בראון 1993). שיקולים נוספים הם בצום בהמשך.
לטווח הארוך צום: מצאנו כי צום של 72 שעות נדרשת ירידה רמת הסוכר בדם לרמה הבסיסית לפני הזרקת (איימס et al, 2010).. מצאנו גם כי מחקרים גלוקוז יש מספר הליכים הנדרשים על מנת להבטיח כי דגים הם צמו כראוי. התחל עם טנק נקי (ללא פסולת על הקרקעית). טנקים צריך להיות מחובר, מסומן בבירור "צום", וגם במקום שבו נלהב טיפול אנשי הדג לא להאכיל אותם. הערכת הסביבה החיצונית של הטנק לנקוט צעדים כדי למנוע את הדג מלהיות הדגיש מהפרעות, כמו מתח ידועה להעלות את רמת הסוכר בדם (צ'אווין ו יאנג, 1970;. גרוף et al, 1999). לדוגמה, היה לנו ניסוי צום בו רדיו הופעל יומי על הספסל כי החזיק את הטנקים דגים. מצאנו כי הגלוקוז בדם היה גבוה במיוחד והגיע למסקנה כי הדגים היו לחוצים על ידי תנודות. גורם לחץ נוסף הוא הצפיפות. דגים יש לשמור על צפיפות העולה בקנה אחד עם נוהלי בעלי טוב דגים. לקבלת המלצות, לראות et al ברנד. (2002) ו Westerfield (1995). היו לנו תוצאות טובות צום הדגים שלנו בצפיפות של דגים באקווריום 10-12 9 ליטר (עם 3 שכבות של גולות תופס כמה נפח זה). הפרדת המינים עלולה לגרום ללחץ, לכן אנו ממליצים לשמור על אוכלוסייה מעורבת מין במהלך הצום. משמעות הדבר היא כי ניתן להניח ביצים, ואת הביצים צריך להיות מוחרם, כך שהם לא יהיו נאכלים. דרך פשוטה לעקל ביצים היא לכסות את תחתית המיכל עם 2-3 שכבות של גולות. איכות המים צריך להיות מתוחזק על ידי הוצאת ביצים פסולת על ידי החלפת 10-15% ממי האקווריום, מדי יום. להסרת ביצים פסולת, והעברתם עובד היטב.
שקילה: כששוקלים דגים כי הם לא הרדים, יש להקפיד למזער העברת מים מן הרשת אל תוך הכוס, כדי להבטיח שקילה מדויקת. אם נטו (עם דגים) נמחקת על מגבות נייר, רוב המים העודפים ניתן להסיר, ואת משקל ניתן למדוד במדויק. זה יכול להיות קל יותר להרדים את הדג לפני שקילה, אבל אנחנו לא בחנו את ההשפעות האפשריות של הרדמה דג פעמיים ביום אחד. בדקנו את הטכניקה שלנו על ידי שקילת הדגים הראשון עם רשתות / סופג שיטה ואז שקילה מחדש את הדג לאחר שהוא מרדים, בעדינות מחק יבש. לא מצאנו הבדל משמעותי בין השיטות משקל (p = 0.7927, t-test). בנוסף, בדקנו אם זו הרשת / סופג הגלוקוז בדם מושפע השיטה, לעומת פשוט להעביר את הדגים כוס ברגע זה מרושת (לא סופג). לא מצאנו הבדל משמעותי ברמת הגלוקוז בדם בין שתי שיטות להעברת (p = 0.2241, t-test).
הרדמה: הרדמה כימית מתאים מחקרים רבים. כאן יש לנו הפגינו הרדמה במים קרים כחלופה, כי הרדמה רבים (כולל tricaine/MS-222 (בראון, 1993)), להעלות את רמת הסוכר בדם. במחקרים קודמים, יש לנו מים קרים נקבע כי אין להעלות את רמת הסוכר בדם של דג הזברה (איימס et al. 2010).
עבור הרדמה מים קרים, הטמפרטורה צריכה להיות ירד לאט. שיעור ירידה דומה תלוי בגודל של הדג, עם דגים קטנים הולך תחת מהר יותר מאשר דג גדול יותר. בעקבות הזרקה, ייתכן לצפות כי הדג הוא מחלים לאט מדי של חומר הרדמה (ראה להלן). זה יכול לגרום גם כאשר הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי, או כאשר הטמפרטורה יורדת מהר מדי. הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי אם מתכופף דגים רוחבית עם כניסתו למים. אם טמפרטורת המוצא היא נכונה, דגים יהיה לשמור על איזון שלה בתחילה. זה יהיה לסובב סנפירי החזה שלו למצב אופקי, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. בדרך כלל, זה יהיה לשחות. כאשר הטמפרטורה יורדת, תנועות יקטין ודגים יאבדו את שיווי המשקל. מטוס של הרדמה כירורגית הוא הגיע כאשר הדגים ניתן לטפל בלא להגיב. כדי לשמור על דגים תחת הרדמה כירורגית, האצבעות שלך חייב להיות קר, כדי לשמור אותם במים לפני הטיפול דגים. ספוג צריך גם להישמר בקירור בטמפרטורה זהה המים המשמשים הרדמה הדגים. חשוב להרוות את הספוג במים כי הוא sufficieקר ntly לשמור הרדמה פעם הדגים ממוקמת על זה.
הזרקה: לפני זריקות התחייבות, מומלץ לנתח לפחות דג אחד כדי לקבל תחושה של עובי דופן הגוף. זה יכול לעזור לך לשפוט עד כמה המחט צריך להכניס להזין את חלל הבטן. בנוסף, כפי שאתה מכניס את המחט, אתה יכול להרגיש את הקיר הגוף "לתת" כאשר המחט חודר את חלל הבטן. במהלך הזריקה, לנקוט בצעדים כדי לשמור על החולה מאושר. ודא ספוג רווי מים קרים בטמפרטורה הנכונה כדי למנוע את הדגים להחיות במהלך ההזרקה. ספוג היטב רווי רך חשוב מזעור הנזק קשקשים וריר כיסוי של העור. ספוג היטב רווי חשוב גם לשמירה על הזימים סודה. אנו ממליצים בחום את הספוג קצף המפורטים להלן תחת חומרים. לבסוף, פעם הדג הוא הרדים, לעבוד במהירות כדי לצמצם את זמן הדג נמצא תחת.
השחזור: הדג צריך להתאושש ההרדמה כמעט עם כניסתו מיכל מים חמים. אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, בעדינות מערבולת המים לעבר הזימים שלו כדי להאיץ התאוששות. אם התאוששות איטית, אז הדג אל מתחת מהר מדי ואתה צריך להתאים את הליך ההרדמה כראוי. הסיבות האפשריות של התאוששות איטית נידונים תחת הרדמה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation מענק 5-2007-97 (עד VEP), על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מענקים R01DK064973 (עד VEP), R01DK48494 (עד LHP), T32DK07074 (תמיכה SCE), K01DK083552 (כדי MDK), ועל ידי P60DK20595 לאוניברסיטת מחקר סוכרת שיקגו מרכז הדרכה. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDDK או NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
