Summary
हम वयस्क zebrafish में intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शित करता है. हम एक 10 μl NanoFil Micro4 नियंत्रक और UltraMicroPump क्ष्क्ष्क्ष् द्वारा नियंत्रित microsyringe का उपयोग करें. यह प्रदर्शन एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि के रूप में ठंडे पानी का उपयोग भी शामिल है.
Abstract
रासायनिक zebrafish के इलाज के लिए एक सुविधाजनक तरीका के लिए पानी के टैंक है, जहां यह मछली द्वारा लिया जाएगा में अभिकर्मक परिचय है. हालांकि, इस विधि का यह मुश्किल पता करने के लिए कितना अभिकर्मक अवशोषित या मछली के प्रति लिया बनाता है. कुछ प्रयोगात्मक सवाल, विशेष रूप से चयापचय के अध्ययन के लिए उन से संबंधित, बेहतर प्रत्येक मछली, वजन के आधार पर करने के लिए एक परिभाषित मात्रा देने से संबोधित किया जा सकता है. यहाँ हम वयस्क zebrafish में intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के लिए एक तरीका मौजूद है. इंजेक्शन उदर गुहा में है, श्रोणि करधनी के लिए पीछे. यह प्रक्रिया पशु बड़ी मछली के लिए इस्तेमाल किया तरीकों से अनुकूलित है. यह सुरक्षित है, के रूप में हम शून्य मृत्यु दर मनाया. इसके अतिरिक्त, हम 127 इंजेक्शन के केवल 5 में इंजेक्शन स्थल पर खून बह रहा है देखा है, और उन मामलों में से प्रत्येक में खून बह रहा है और संक्षिप्त, स्थायी कई सेकंड था, और खो खून की मात्रा छोटा था. इस प्रक्रिया के साथ सफलता उपवास सहित कई कदम के माध्यम से मछली की कोमल से निपटने की आवश्यकता है,, anesthetizing, इंजेक्शन वसूली, और वजन. सावधानियों प्रक्रिया के दौरान तनाव को कम करने के लिए आवश्यक हैं. हमारे सावधानियों एक छोटे से इंजेक्शन की मात्रा और एक 35G सुई का उपयोग शामिल है. हम Cortland वाहन है, जो osmotically मीठे पानी में मछली के लिए संतुलित है के रूप में नमक समाधान का उपयोग करें. पहले संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान है, जो धीमी गति से operculum आंदोलनों की अनुमति देता है में मछली लाकर गहरे नाले के वातन इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा है, और एक स्पंज पानी संतृप्त के भीतर ही इंजेक्शन के दौरान एक गर्त में मछली पकड़ दूसरा,. हम ग्लूकोज इंजेक्शन और रक्त शर्करा के स्तर में वृद्धि और सामान्य करने के लिए बाद में वापसी की निगरानी के द्वारा आईपी इंजेक्शन की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. के रूप में तनाव को teleost मछली में रक्त ग्लूकोज में वृद्धि करने के लिए जाना जाता है, हम वाहन इंजेक्शन और गैर इंजेक्शन वयस्कों में रक्त शर्करा के स्तर की तुलना और दिखाने के लिए कि प्रक्रिया रक्त ग्लूकोज में एक उल्लेखनीय वृद्धि का कारण नहीं है.
Protocol
1. पूर्व इंजेक्शन तैयारी
- फास्ट इंजेक्शन से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए मछली. यह आंतों बल्ब सामग्री (पेट) खाली होगा. बुनियादी उपवास प्रोटोकॉल मछली हस्तांतरण करने के लिए, अपने सामान्य घनत्व पर एक साफ टैंक है, तो भोजन रोक. लंबी अवधि के उपवास कि और अधिक कठोर परिस्थितियों की आवश्यकता होती है (जैसे, रक्त ग्लूकोज के अध्ययन के लिए) के लिए, चर्चा में अतिरिक्त विचार देखें.
- Cortland नमक समाधान (पेरी एट अल. 1984) तैयार करें .
100 एमएल मात्रा के लिए, आसुत जल में निम्नलिखित भंग:
725 मिलीग्राम NaCl (124.1 मिमी)
38 मिलीग्राम KCl (5.1 मिमी)
41 मिलीग्राम 2 ना HPO 4 (2.9 मिमी)
24 मिलीग्राम MgSO 4 ∙ 7 2 हे (1.9 मिमी)
16 मिलीग्राम 2 CaCl ∙ 2H 2 O (1.4 मिमी)
100 मिलीग्राम NaHCO 3 (11.9 मिमी)
4 जी (PVP) Polyvinylpyrrolidone (4%)
१,००० खासियत इकाइयों हेपरिन
फ़िल्टर, बाँझ और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस - माइक्रोस्कोप तैयार.
- फैल के मामले में सुरक्षा के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ खुर्दबीन के आधार कवर.
- प्लास्टिक की चादर के शीर्ष पर एक कागज तौलिया रखो. शल्य तालिका कागज तौलिया के शीर्ष पर बैठेंगे.
- पूर्व समायोजित शल्य तालिका देखने और स्पंज पर ध्यान केंद्रित करके ध्यान केंद्रित.
- मछली वजन.
- 500 के बारे में 1 / 3 मछली की सुविधा के पानी के साथ पूर्ण एमएल बीकर भरें.
- धड़ा संतुलन.
- एक शुद्ध मछली का उपयोग कर लीजिए. अतिरिक्त पानी को शुद्ध और संक्षेप में कागज तौलिए पर नेट dabbing द्वारा मछली से दूर बाती. बीकर मछली स्थानांतरण.
- मछली वजन.
- एक साफ टैंक मछली स्थानांतरण.
- अपने स्वयं के लेबल टैंक के लिए प्रत्येक तौला मछली स्थानांतरण.
- प्रत्येक मछली वजन के आधार पर मछली के लिए इंजेक्शन की मात्रा की गणना.
- सिरिंज और संबंधित इंजेक्शन उपकरण तैयार. इंजेक्शन के लिए, हम एक 35G beveled इस्पात सुई और एक 10 μl NanoFil microsyringe सलाह देते हैं. NanoFil सिरिंज और निर्माता के निर्देशों का पालन silflex टयूबिंग तैयार करें. यह सिरिंज और टयूबिंग से किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. सिरिंज और टयूबिंग भरने के बाद, सिरिंज पंप पर माउंट, और पहली मछली के लिए इंजेक्शन की मात्रा कार्यक्रम.
- शल्य तालिका तैयार.
- काटें एक नरम स्पंज (जैसे # L800 - डी, Jaece उद्योग के रूप में) इतना है कि यह ऊंचाई में लगभग 20 मिमी है. फ्लैट चेहरे पर एक कट जाता है कि 10-15 गहरी मिमी है. यह कटौती गर्त कि इंजेक्शन के लिए मछली का आयोजन करेगा है.
- एक 60 मिमी पेट्री डिश में स्पंज सेट.
- एक उपयुक्त आकार विंदुक टिप बॉक्स ढक्कन में स्पंज के साथ पेट्री डिश सेट. ढकने के लिए पर्याप्त बड़ी मदद स्पंज का तापमान बनाए रखने के लिए पानी पकड़ की जरूरत है, लेकिन यह पर्याप्त उथले रास्ते में पाने के लिए नहीं होना चाहिए. हम P200 टिप बॉक्स है कि 11.4 सेमी एल एक्स 7.7 सेमी डब्ल्यू एक्स 1.5 सेमी से एक ढक्कन का उपयोग डी.
- चतनाशून्य करनेवाली औषधि तैयार.
- कुचल बर्फ मछली सुविधा पानी से बना क्यूब्स का उपयोग करें.
- कुचल बर्फ के साथ एक साफ बर्फ बाल्टी भरें.
- एक 2.4 लीटर Rubbermaid खाद्य भंडारण कंटेनर के रूप में एक बड़े कंटेनर में शल्य चिकित्सा तालिका रखो.
- बाहरी कंटेनर और शल्य चिकित्सा तालिका में कुछ सुविधा (गर्म) पानी डालो. गर्म सुविधा के पानी की एक आरक्षित पास रखें.
- बाहरी कंटेनर में एक थर्मामीटर रखो.
2. संज्ञाहरण, इंजेक्शन, और रिकवरी
- संवेदनाहारी बाहरी कंटेनर प्लस शल्य खुर्दबीन के लिए आसन्न तालिका रखें. बर्फ चिप्स की बाल्टी पास है.
- पानी के तापमान को नीचे लाने के 17 डिग्री सेल्सियस बर्फ चिप्स जोड़कर. महत्वपूर्ण: 17 ° C से नीचे इस कदम के लिए मत जाओ.
- एक शुद्ध का उपयोग करने के लिए बाहरी कंटेनर के लिए मछली हस्तांतरण के लिए.
- धीरे कंटेनर बर्फ चिप्स जोड़ने के तापमान को नीचे लाने के 12 डिग्री सेल्सियस, कई मिनट के पाठ्यक्रम पर.
- मॉनिटर मछली व्यवहार: 17 से कम डिग्री सेल्सियस या थोड़ा कम, मछली आम तौर पर अपनी छाती पर का कवच पंख क्षैतिज फैल जाएगा, दम तोड़ देना, और तेजी से operculum आंदोलनों है. जैसा कि तापमान बूँदें, मछली और अधिक धीरे धीरे और अंत में तैरना तैराकी बंद हो जाएगा. संज्ञाहरण के सर्जिकल विमान के रूप में संपर्क किया है, हांफते operculum आंदोलनों बंद करो और धीमी हो जाएगी. मछली इंजेक्शन के लिए तैयार है जब यह करने के लिए नियंत्रित किया जा रहा प्रतिक्रिया नहीं करता है. सबसे मछली, 12 डिग्री सेल्सियस के लिए पर्याप्त है. बड़ी मछली ठंडा वा की आवश्यकता हो सकती हैआतंकवाद.
- के रूप में आवश्यक तापमान प्रेस (~ 12 ° C ठंडा या), यह तर स्पंज पर पहुँच जाता है.
- पर्याप्त तो ठंडे पानी में अपनी उंगलियों रखें कि वे मछली नहीं गर्म और इसे बाहर लाने से निपटने के दौरान संज्ञाहरण के.
- ठंड उंगलियों के साथ, धीरे स्पंज की गर्त मछली हस्तांतरण. गर्त में पेट और गहरे नाले के साथ मछली स्थिति.
- जल्दी खुर्दबीन मंच शल्य मेज हस्तांतरण.
- जल्दी से कार्य करना, ध्यान पैल्विक पंख के बीच midline में सुई डालने. सुई बिंदु cranially और गुदा से श्रोणि करधनी के करीब सम्मिलित करना चाहिए. आप को लगता है जब सुई शरीर दीवार को गहरा है सक्षम होना चाहिए. उचित मात्रा इंजेक्षन और सुई वापस लेने.
- इंजेक्शन के बाद, तुरंत मछली हस्तांतरण वापस अपने गर्म पानी (28.5 ~ डिग्री सेल्सियस) मछली टैंक पानी से अधिक स्पंज से रिहा द्वारा वसूली के लिए टैंक.
सुझाव: अगर मछली नहीं तुरंत तैराकी शुरू करता है, यह गहरे नाले की ओर धीरे पानी घूमता द्वारा ठीक करने में मदद. - सुई की जाँच करें. कभी कभी एक पैमाने और संलग्न किया जा सकता है अगले इंजेक्शन के लिए पहले हटा दिया जाना चाहिए.
- बाद इंजेक्शन के लिए, गर्म सुविधा पानी का उपयोग कर से 17 डिग्री सेल्सियस अगले मछली शुरू करने से पहले चतनाशून्य करनेवाली औषधि कक्ष पानी का तापमान वापस लाने के ऊपर है.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 0.5 मिलीग्राम / छ ग्लूकोज या वाहन की intraperitoneal इंजेक्शन के बाद प्रतिनिधि परिणाम है . मछली इंजेक्शन के लिए पहले 72 घंटे के लिए उपवास थे. x-अक्ष समय, के बाद इंजेक्शन से पता चलता है. मीन ± SEM.
Discussion
Intraperitoneal इंजेक्शन पांच कदम शामिल है: उपवास, वजन, anesthetizing, इंजेक्शन, और वसूली. हर कदम के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं है कि सफलता को सुनिश्चित कर सकते हैं कर रहे हैं. सफलता एक स्वस्थ मछली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अच्छा प्रयोगात्मक परिणाम रोगी शामिल हैं.
उपवास: एक 24 घंटे की तेजी से आंतों बल्ब खाली चाहिए. इस अभ्यास मछली पशु चिकित्सा साहित्य (उदाहरण के लिए, ब्राउन 1993) से लिया जाता है. अतिरिक्त उपवास considerationssee नीचे चर्चा कर रहे हैं.
उपवास दीर्घकालीन: हमने पाया है कि 72 घंटे एक तेजी से एक आधारभूत स्तर पर रक्त ग्लूकोज इंजेक्शन के पहले कमी के लिए आवश्यक है (Eames एट अल, 2010 ). हम यह भी पाया है कि ग्लूकोज के अध्ययन के लिए कई प्रक्रियाओं है कि करने के लिए सुनिश्चित करें कि मछली ठीक से उपवास कर रहे हैं आवश्यक हैं. एक साफ टैंक (तल पर कोई मलबे) के साथ शुरू करो. टैंक ऑफ़लाइन हो सकता है, 'उपवास' के रूप में स्पष्ट रूप से लेबल करना चाहिए, और एक स्थान में जहां उत्साही मछली देखभाल कर्मियों उन्हें फ़ीड नहीं होगा. टैंक के बाहरी वातावरण का मूल्यांकन और कदम उठाने से मछली को रोकने गड़बड़ी से जोर दिया जा रहा है, के रूप में तनाव के लिए रक्त में ग्लूकोज (Chavin और यंग, 1970; Groff एट अल, 1999) जुटाने के लिए जाना जाता है. उदाहरण के लिए, हम एक उपवास है जो प्रयोग में एक रेडियो दैनिक बेंच है कि मछली टैंक पकड़े हुए था पर संचालित किया गया था था. हमने पाया है कि असामान्य रूप से उच्च रक्त ग्लूकोज और निष्कर्ष निकाला है कि मछली कंपन से बल दिया गया. एक अन्य stressor के भीड़भाड़ है. मछली की एक घनत्व है कि अच्छा मछली पालन प्रथाओं के साथ अनुरूप है पर रखा जाना चाहिए. सिफारिशों के लिए, ब्रांड एट अल देखें. (2002) और (1995) Westerfield. हम एक 9 लीटर टैंक कि मात्रा के कुछ ले पत्थर के 3 परतों के साथ () में 10-12 मछली के घनत्व पर हमारे मछली उपवास अच्छा परिणाम मिला है. लिंगों अलग तनाव का कारण हो सकता है, तो हम तेजी के दौरान एक मिश्रित सेक्स जनसंख्या को बनाए रखने की सिफारिश. इसका मतलब यह है कि अंडे रखी जा सकता है, और अंडे तनहा हो सकता है ताकि वे खा नहीं किया जाएगा जरूरत है. अंडे पृथक करने के लिए एक सरल तरीका करने के लिए पत्थर के 2-3 परतों के साथ टैंक नीचे कवर करने के लिए है. अंडे और अपशिष्ट को हटाने के द्वारा और टैंक पानी के बारे में 10-15%, दैनिक जगह से पानी की गुणवत्ता बनाए रखने की जरूरत है. अंडे और अपशिष्ट को हटाने, वसूलना के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
वजनी: जब मछली कि anesthetized नहीं कर रहे हैं वजन, देखभाल नेट से बीकर में पानी हस्तांतरण, सही वजन कम करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. यदि शुद्ध मछली के साथ () कागज तौलिए पर blotted, अतिरिक्त पानी के बहुमत, हटाया जा सकता है और वजन को सही मापा जा सकता है. यह मछली का वजन पहले anesthetize आसान हो सकता है, लेकिन हम एक मछली एक दिन में दो बार anesthetizing के संभावित प्रभावों का परीक्षण नहीं किया है. हम मछली जाल / विधि सोख्ता और तब फिर से वजन मछली के साथ पहली वजन के बाद यह anesthetized किया गया है द्वारा हमारी तकनीक का परीक्षण किया है, और धीरे से सूखी blotted. हम तरीकों के बीच कोई वजन में एक महत्वपूर्ण अंतर पाया (= पी .7927, टी - परीक्षण). इसके अतिरिक्त, हम परीक्षण किया है कि क्या इस जाल / विधि प्रभावित रक्त ग्लूकोज बस बीकर के लिए मछली के रूप में जल्द ही स्थानांतरित करने के रूप में यह (सोख्ता कोई) netted है के साथ तुलना में, सोख्ता. हम रक्त शर्करा के स्तर में दो हस्तांतरण के तरीकों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया (पी = 0.2241, टी परीक्षण).
Anesthetizing: रासायनिक संज्ञाहरण कई अध्ययनों के लिए उपयुक्त हो सकता है . यहाँ हम एक विकल्प के रूप में ठंडे पानी संज्ञाहरण प्रदर्शन किया है, क्योंकि कई anesthetics (tricaine/MS-222 (ब्राउन, 1993) सहित), रक्त शर्करा बढ़ा. पिछले अध्ययनों में, हम निर्धारित किया है कि ठंडे पानी zebrafish में रक्त ग्लूकोज उठाना नहीं करता है (Eames एट अल., 2010).
ठंडे पानी संज्ञाहरण के लिए, तापमान धीरे धीरे कम किया जाना चाहिए. कमी की दर से मछली के आकार पर निर्भर छोटी मछली बड़ी मछली की तुलना में तेजी से नीचे जा रहा लगता है. इंजेक्शन के बाद, आप का पालन हो सकता है कि मछली भी धीरे धीरे संवेदनाहारी से उबरने है (नीचे देखें). यह परिणाम कर सकते हैं या तो जब शुरू तापमान बहुत कम है, या जब तापमान बहुत तेजी से कमी आई है. शुरू तापमान बहुत कम पानी में प्रवेश करने पर अगर मछली झुकता laterally है. यदि प्रारंभिक तापमान सही है, मछली अपने संतुलन बनाए रखने के शुरू होगा. यह एक क्षैतिज स्थिति के लिए अपनी छाती पर का कवच पंख बारी बारी से दम तोड़ देना होगा, और तेजी से operculum आंदोलनों है. आमतौर पर, यह तैर जाएगा. तापमान घट जाती है के रूप में, आंदोलनों कम होती है और मछली संतुलन खो देंगे. संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान जब मछली प्रतिक्रिया के बिना नियंत्रित किया जा सकता तक पहुँच जाता है. शल्य संज्ञाहरण के तहत मछली को बनाए रखने के लिए, अपनी उंगलियों को ठंड हो सकता है, तो उन्हें पानी में मछली को संभालने से पहले रखना चाहिए. स्पंज भी उसी के तापमान पर ठंडा मछली anesthetizing के लिए प्रयुक्त पानी के रूप में रखा जाना. यह महत्वपूर्ण है कि sufficie है पानी के साथ स्पंज तरntly संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए एक बार मछली पर रखा गया है ठंडा है.
इंजेक्शन: उपक्रम इंजेक्शन से पहले, आप कम से कम एक मछली काटना शरीर दीवार मोटाई की भावना पाने के लिए चाहते हो सकता है. यह तुम कितनी दूर सुई सम्मिलित करने के लिए उदर गुहा में प्रवेश की जरूरत न्यायाधीश करने के लिए मदद कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, के रूप में आप सुई सम्मिलित, आप महसूस कर सकते हैं शरीर दीवार "देने" जब सुई उदर गुहा में प्रवेश करती है. इंजेक्शन के दौरान, कदम उठाने के लिए मरीज को खुश रखने के. सुनिश्चित करें कि स्पंज सही तापमान ठंडे पानी के साथ संतृप्त है इंजेक्शन के दौरान पुनर्जीवित से मछली को रोकने. एक अच्छी तरह से संतृप्त और नरम स्पंज तराजू और त्वचा के कवर बलगम के लिए नुकसान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक अच्छी तरह से संतृप्त स्पंज भी गहरे नाले वातित रखने के लिए महत्वपूर्ण है. हम अत्यधिक फोम स्पंज सामग्री के तहत नीचे सूचीबद्ध की सलाह देते हैं. अंत में एक बार मछली anesthetized है, जल्दी से काम के लिए समय है कि मछली के तहत है कम से कम.
वसूली: मछली संज्ञाहरण से गर्म पानी के टैंक में प्रवेश करने पर लगभग ठीक होना चाहिए. अगर मछली नहीं तुरंत तैराकी, धीरे से इसकी वसूली की गति गहरे नाले की ओर पानी ज़ुल्फ़ शुरू करता है. यदि वसूली धीमी है, तो मछली के तहत भी जल्दी चला गया और आप संज्ञाहरण प्रक्रिया उचित रूप से समायोजित करना चाहिए. धीमी गति से वसूली के संभावित कारणों Anesthetizing के तहत चर्चा कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन में किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन अनुदान 5-2007-97 (VEP के लिए), मधुमेह और पाचन के राष्ट्रीय संस्थान और गुर्दा रोग के द्वारा समर्थित किया गया R01DK064973 अनुदान (VEP के लिए), R01DK48494 (LHP के लिए), T32DK07074 SCE (समर्थन), K01DK083552 (MDK के लिए), और शिकागो मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र के विश्वविद्यालय के लिए P60DK20595 द्वारा. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता है NIDDK या एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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