Summary
Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l'uso di acqua fredda come anestetico.
Abstract
Un metodo conveniente per trattare chimicamente zebrafish è quello di introdurre il reattivo in acqua serbatoio, dove verrà ripreso dai pesci. Tuttavia, questo metodo rende difficile sapere quanto reagente viene assorbita o ripreso per i pesci. Alcune domande sperimentali, in particolare quelli relativi a studi metabolici, può essere meglio affrontata fornendo una quantità definita per ogni pesce, in base al peso. Qui vi presentiamo un metodo per intraperitoneale (IP) iniezione in zebrafish adulti. L'iniezione è nella cavità addominale, posteriore al cingolo pelvico. Questa procedura è adattato da metodi veterinari utilizzati per pesci più grandi. E 'sicuro, come abbiamo osservato mortalità pari a zero. Inoltre, abbiamo visto sanguinamento nel sito di iniezione in solo 5 su 127 iniezioni, e in ciascuno di questi casi l'emorragia è stata breve, della durata di alcuni secondi, e la quantità di sangue perso era piccola. Successo con questa procedura richiede una gestione delicata del pesce attraverso diversi passaggi tra cui il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Precauzioni necessarie per minimizzare lo stress durante l'intera procedura. Le nostre precauzioni includono l'utilizzo di un piccolo volume di iniezione e un ago 35G. Noi usiamo soluzione salina Cortland come il veicolo, che è osmoticamente bilanciato per pesci d'acqua dolce. L'aerazione delle branchie è mantenuta durante la procedura di iniezione per prima cosa portare il pesce in un piano chirurgico di anestesia, che permette movimenti opercolo lenti, e la seconda, tenendo il pesce in una vasca all'interno di un saturo d'acqua spugna durante la stessa iniezione. Abbiamo dimostrato l'utilità di iniezione IP, iniettando glucosio e il monitoraggio del livello del glucosio nel sangue e il suo successivo ritorno alla normalità. Lo stress è noto per aumentare il glucosio nel sangue nei pesci teleostei, mettiamo a confronto i livelli di glucosio nel sangue in adulti veicolo a iniezione e non per iniezione e dimostrare che la procedura non causa un significativo aumento del glucosio nel sangue.
Protocol
1. Preparativi pre-iniezione
- Veloce il pesce per almeno 24 ore prima dell'iniezione. Questo svuotare il bulbo intestinale (stomaco) contenuti. Il protocollo digiuno di base è quello di trasferire il pesce, a loro densità normale, ad un serbatoio pulito, poi trattenere il cibo. Per lungo periodo di digiuno che richiede condizioni più rigorose (ad esempio, per gli studi di glucosio nel sangue), vedi considerazioni aggiuntive alla discussione.
- Preparare la soluzione salina Cortland (Perry et al., 1984).
Per un volume di 100 mL, sciogliere le seguenti in acqua distillata:
725 mg NaCl (124,1 mM)
KCl 38 mg (5,1 mm)
41 mg di Na 2 HPO 4 (2,9 mm)
24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM)
16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm)
100 mg di NaHCO 3 (11,9 mm)
4 g Polivinilpirrolidone (PVP) (4%)
1.000 unità di eparina USP
Filtro, sterilizzare e conservare a 4 ° C. - Preparare il microscopio.
- Coprire la base del microscopio con pellicola trasparente per la protezione in caso di fuoriuscita.
- Mettete un tovagliolo di carta sulla parte superiore della pellicola trasparente. Il tavolo operatorio siederà sulla parte superiore del tovagliolo di carta.
- Pre-la messa a fuoco visualizzando il tavolo operatorio e concentrandosi sulla spugna.
- Pesare il pesce.
- Riempire un bicchiere da 500 ml circa 1 / pieno con pesci d'acqua impianto di 3.
- Tarare la bilancia.
- Raccogliere il pesce con una rete. Wick l'acqua in eccesso lontano dalla rete e il pesce con una breve tamponando la rete su carta assorbente. Trasferire il pesce nel becher.
- Pesare il pesce.
- Trasferire il pesce in una vasca pulita.
- Trasferimento ogni pesce pesato proprio serbatoio etichettati.
- Calcolare il volume di iniezione per ogni pesce in base al peso del pesce.
- Preparare la siringa d'iniezione e delle attrezzature connesse. Per l'iniezione, si consiglia una 35G ago smussato in acciaio e una microsiringa da 10 microlitri NanoFil. Preparare la siringa e il tubo NanoFil silflex seguendo le istruzioni del produttore. E 'importante rimuovere eventuali bolle dalla siringa e tubo. Dopo aver riempito la siringa e il tubo, montare la siringa sulla pompa, e programmare il volume di iniezione per il primo pesce.
- Preparare il tavolo operatorio.
- Tagliare una spugna morbida (ad esempio # L800-D, Jaece Industrie) in modo che sia di circa 20 mm di altezza. Sulla superficie piatta, fare un taglio che è di 10-15 mm di profondità. Questo taglio è il tramite che conterrà il pesce per l'iniezione.
- Impostare la spugna in un piatto 60 millimetri Petri.
- Impostare la piastra Petri con spugna in una di dimensioni adeguate e coperchio della scatola punta della pipetta. Il coperchio deve essere abbastanza grande da contenere acqua per aiutare a mantenere la temperatura di spugna, ma dovrebbe essere sufficiente per ottenere superficiale non nel modo. Noi usiamo un coperchio di una scatola P200 punta che è di 11,4 cm L x 7,7 cm L x 1,5 cm D.
- Preparare l'anestetico.
- Fai utilizzando cubetti di ghiaccio tritato a base di pesci d'acqua impianto.
- Riempire un secchio pulito ghiaccio con il ghiaccio tritato.
- Mettere il tavolo operatorio in un contenitore più grande, come un contenitore di 2,4 litro di stoccaggio degli alimenti Rubbermaid.
- Versare un pò d'acqua impianto (calda) nel contenitore esterno e il tavolo operatorio. Mantenere una riserva di acqua calda impianto nelle vicinanze.
- Metti un termometro nel contenitore esterno.
2. Anestesia, iniezione e di recupero
- Posizionare il contenitore esterno e anestetico tavolo operatorio adiacente al microscopio. Hanno il secchio di cubetti di ghiaccio vicine.
- Portare la temperatura dell'acqua fino a 17 ° C con l'aggiunta di pezzetti di ghiaccio. Importante: non scendere sotto i 17 ° C per questo passo.
- Utilizzare una rete per trasferire il pesce al contenitore esterno.
- Lentamente aggiungere cubetti di ghiaccio al contenitore per portare la temperatura fino a 12 ° C, nel corso di diversi minuti.
- Monitorare il comportamento dei pesci: A 17 ° C o leggermente inferiore, il pesce tipicamente diffonderà i suoi pettorali in orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Quando la temperatura scende, i pesci nuotano più lentamente e finalmente smettere di nuotare. Mentre l'aereo chirurgico di anestesia si avvicina, ansimante si ferma e rallenta i movimenti opercolo. Il pesce è pronto per l'iniezione quando non reagisce a essere maneggiati. Per la maggior parte dei pesci, 12 ° C è sufficiente. I pesci più grandi può richiedere più fredde water.
- Come la temperatura desiderata viene raggiunta (~ 12 ° C o inferiore), premere sulla spugna per saturare esso.
- Tenete le dita in acqua fredda a sufficienza in modo che non si riscalda il pesce e portarlo fuori di anestesia durante la manipolazione.
- Con le dita fredde, delicatamente trasferire il pesce al trogolo della spugna. Posizionare il pesce con l'addome e le branchie nel trogolo.
- Trasferire rapidamente il tavolo operatorio alla fase microscopio.
- Lavorare con rapidità, accuratezza inserire l'ago nella linea mediana tra le pinne pelviche. L'ago deve puntare cranialmente ed essere inseriti più vicino al cingolo pelvico che per l'ano. Dovreste essere in grado di sentire quando l'ago è profondo alla parete del corpo. Iniettare il volume appropriato e ritirare l'ago.
- Dopo l'iniezione, trasferire immediatamente il pesce alla sua acqua calda (~ 28,5 ° C) Serbatoio per il recupero rilasciando il pesce dalla spugna sopra l'acqua del serbatoio.
Suggerimento: se il pesce non inizia immediatamente nuoto, aiutarla a recuperare rimestando delicatamente acqua verso le branchie. - Controllare l'ago. Occasionalmente una scala può essere fissata e deve essere rimosso prima della successiva iniezione.
- Per le successive iniezioni, usare acqua tiepida struttura per portare la temperatura della camera anestetico acqua torna fino a 17 ° C prima di introdurre il pesce successiva.
3. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Rappresentante risultati dopo l'iniezione intraperitoneale di 0,5 mg / g di glucosio o di un veicolo. Pesci sono stati a digiuno per 72 ore prima dell'iniezione. L'asse x mostra il tempo, dopo l'iniezione. Media ± SEM.
Discussion
Iniezione intraperitoneale prevede cinque fasi: il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Per ogni tappa ci sono buone pratiche che possono assicurare il successo. Successo include un paziente sano pesce, nonché un buon risultato sperimentale.
Il digiuno: A 24 ore di digiuno dovrebbe svuotare il bulbo intestinale. Questa pratica è tratto dalla letteratura veterinaria pesce (per esempio, Brown, 1993). Ulteriori considerazioni digiuno sono discussi di seguito.
A lungo termine il digiuno: Abbiamo scoperto che una di 72 ore di digiuno è richiesto di ridurre il glucosio nel sangue a un livello base prima dell'iniezione (Eames et al, 2010).. Abbiamo anche scoperto che per gli studi di glucosio ci sono diverse procedure che sono necessarie per garantire che i pesci sono a digiuno in modo corretto. Inizia con un serbatoio pulito (senza residui sul fondo). Cisterne devono essere in linea, chiaramente etichettati come 'digiuno', e in una posizione dove entusiasta personale di assistenza di pesce non li alimentano. Valutare l'ambiente esterno della cisterna e di prendere misure per evitare che il pesce venga sottolineato da disturbi, come lo stress è noto per aumentare la glicemia (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Per esempio, abbiamo avuto un esperimento digiuno in cui è stato operato una radio ogni giorno sulla panchina che aveva in mano le vasche dei pesci. Abbiamo scoperto che il glucosio nel sangue era insolitamente alto e ha concluso che i pesci erano sottolineato dalle vibrazioni. Un altro fattore di stress è il sovraffollamento. I pesci devono essere mantenuti a una densità che è conforme con le buone pratiche di allevamento dei pesci. Per i consigli, vedere Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Abbiamo avuto buoni risultati digiuno nostri pesci con una densità di 10-12 pesci in un acquario 9 litro (con 3 strati di marmi occupare parte di questo volume). La separazione dei sessi può causare stress, quindi si consiglia di mantenere un misto di sesso popolazione durante il digiuno. Ciò significa che le uova possono essere deposte, e le uova devono essere sequestrato in modo che non sarà mangiato. Un modo semplice per sequestrare le uova è di coprire il fondo della vasca con 2-3 strati di marmi. La qualità dell'acqua deve essere mantenuto, eliminando uova e rifiuti e sostituendo circa il 10-15% dell'acqua della vasca, tutti i giorni. Per la rimozione di uova e rifiuti, sifone funziona bene.
Peso: quando pesare i pesci che non sono anestetizzate, si dovrebbe aver cura di ridurre al minimo il trasferimento di acqua dalla rete nel becher, per garantire la precisione di pesatura. Se la rete (con pesce) è cancellata su carta assorbente, la maggior parte l'acqua in eccesso può essere rimosso, e il peso può essere misurata con precisione. Può essere più facile per anestetizzare il pesce prima della pesata, ma non abbiamo testato gli effetti possibili di anestetizzare un pesce due volte in un giorno. Abbiamo testato la nostra tecnica pesando il primo pesce con la rete / assorbente metodo e poi pesando il pesce dopo che è stato anestetizzato, e delicatamente asciugate. Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel peso tra i metodi (P = 0,7927, t-test). Inoltre, abbiamo testato se questa rete / assorbente di glucosio nel sangue colpite metodo, rispetto al semplice trasferimento del pesce al bicchiere non appena si compensano (senza assorbente). Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel livello di glucosio nel sangue tra i due metodi di trasferimento (p = 0,2241, t-test).
L'anestesia: l'anestesia chimica può essere adatto a molti studi. Qui abbiamo dimostrato l'anestesia acqua fredda, in alternativa, in quanto gli anestetici molti (tra cui tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentare il glucosio nel sangue. In studi precedenti, abbiamo stabilito che l'acqua fredda non solleva glicemia nel pesce zebra (Eames et al., 2010).
Per l'anestesia acqua fredda, la temperatura deve essere ridotta lentamente. Il tasso di riduzione sembra dipendere dalle dimensioni del pesce, con pesci più piccoli di andare sotto più veloce di pesci più grandi. Dopo l'iniezione, si può osservare che il pesce si sta riprendendo da troppo lentamente l'anestetico (vedi sotto). Ciò può portare, quando sia la temperatura iniziale è troppo bassa, o quando la temperatura diminuisce troppo rapidamente. La temperatura di partenza è troppo bassa se il pesce si piega lateralmente entrando l'acqua. Se la temperatura di partenza è corretto, il pesce mantiene il suo equilibrio inizialmente. Ruoterà sue pinne pettorali in posizione orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Tipicamente, si nuotare. Al diminuire della temperatura, i movimenti si riduce e il pesce perde l'equilibrio. Un aereo chirurgico di anestesia viene raggiunta quando il pesce può essere gestita senza reagire. Per mantenere il pesce in anestesia chirurgica, le dita devono essere fredde, in modo da tenerli in acqua prima del trattamento del pesce. La spugna deve essere mantenuto freddo alla stessa temperatura come l'acqua utilizzata per anestetizzare i pesci. E 'importante saturare la spugna con l'acqua che è sufficiently freddo per mantenere l'anestesia una volta che il pesce viene posto su di esso.
Iniezione: Prima di iniezioni di impresa, si consiglia di analizzare almeno un pesce per avere un'idea dello spessore della parete del corpo. Questo può aiutare a valutare in quale misura l'ago deve inserire per accedere alla cavità addominale. Inoltre, come si inserisce l'ago, si può sentire la parete del corpo "dare" quando l'ago entra nella cavità addominale. Durante l'iniezione, prendere misure per mantenere il paziente felice. Assicurarsi che la spugna è saturata con l'acqua fredda della temperatura corretta per evitare che il pesce da far rivivere durante l'iniezione. Una spugna ben saturi e morbida è importante per minimizzare i danni alle scale e muco la copertura della cute. A ben saturi spugna è importante anche per mantenere le branchie aerato. Consigliamo vivamente la spugna in schiuma di seguito elencati sotto Materiali. Infine, una volta che il pesce è anestetizzato, lavorare velocemente per minimizzare il tempo che il pesce è sotto.
Recupero: Il pesce deve riprendersi dalla anestesia praticamente entrando l'acqua calda del serbatoio. Se il pesce non inizia immediatamente nuoto, capovolgere delicatamente l'acqua verso le branchie per accelerare il recupero. Se il recupero è lento, poi il pesce è andato sotto troppo in fretta e si dovrebbe regolare la procedura di anestesia in modo appropriato. Le possibili cause della lenta ripresa sono discussi in Anestesia.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da Juvenile Diabetes Research Foundation concedere 5-2007-97 (a PEV), dall'Istituto Nazionale del Diabete e digestive e Malattie Renali concede R01DK064973 (a PEV), R01DK48494 (a LHP), T32DK07074 (supporto SCE), K01DK083552 (a MDK), e da P60DK20595 per L'Università di Chicago Ricerca Diabete e Training Center. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIDDK o il NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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