Summary
我々は、成体ゼブラフィッシュに腹腔内注射を示しています。我々はMicro4コントローラとUltraMicroPump IIIによって制御される10μlのNanoFilマイクロシリンジを使用してください。このデモでは、麻酔薬として冷たい水の使用が含まれています。
Abstract
化学的にゼブラフィッシュを治療するための便利な方法は、それが魚に取り込まれるタンクの水に試薬を導入することである。しかし、この方法では、それが困難な試薬が吸収されるか、または魚ごとに取り上げているどのくらい知っています。特にいくつかの実験的な質問、代謝の研究に関連するものが、より重量に基づいて、それぞれの魚に定義された量を提供することで対処することができます。ここでは、成人のゼブラフィッシュに腹腔内（IP）注入のための手法を提案する。注射は、腹腔内に骨盤に後方である。この手順は、より大きい魚のために使用される獣医の方法から構成されている。我々はゼロの死亡率を観察しているとして、それは、安全です。さらに、我々は127の注射だけうち5における注射部位の出血を見てきました、そしてそれらのそれぞれの場合に出血は簡単な、持続数秒であり、失われた血液の量が少なかった。この手順での成功は、麻酔、注射、および回復の重量を量る、空腹時を含めていくつかのステップを通じて、魚の穏やかな処理が必要です。注意事項は、プロシージャ全体でストレスを最小限にするために必要です。私たちの注意事項は、小さな注入量と35Gの針を使用して含まれています。我々は、浸透淡水魚のために釣り合っている車両、としてコートランドの塩溶液を使用してください。鰓の通気は、注射自体の間に水で飽和したスポンジの中トラフで魚を保持することによって、最初の手術が遅い蓋の動きを可能にする麻酔の飛行機、、第二に、魚を持って来ることによって注入手順の間に維持されます。我々は、グルコースを注入し、血糖値の上昇と正常にその後の復帰を監視することによって、IP注射の有用性を実証する。ストレスが魚類の血糖値を高めるために知られているように、我々は車両の注入および非注入成人で血糖値を比較すると手続きが血糖値の有意な上昇が発生しないことを示している。
Protocol
1。注射前の準備
- 注射前に少なくとも24時間の速い魚。これは腸の電球（胃）の内容を空にします。基本的な空腹時のプロトコルは、クリーンタンクに、彼らの通常の密度で、魚を転送する場合、次に食べ物を差し控える。 （例えば、血糖の研究のための）より厳密な条件を必要とする長期的な断食の場合は、ディスカッションの追加の考慮事項を参照してください。
- コートランドの塩溶液（ペリーら 、1984）を準備する。
100mLの容積のために、蒸留水に次のように溶かす。
725 mgを塩化ナトリウム（124.1 mM）を
38ミリグラムのKCl（5.1 mM）を
41ミリグラムのNa 2 HPO 4（2.9 mM）を
24mgのMgSO 4を ∙7H 2 O（1.9 mM）を
16mgの塩化カルシウム∙2H 2 O（1.4 mM）を
100mgを飽和NaHCO 3（11.9 mM）を
4グラムポリビニルピロリドン（PVP）（4％）
千USP単位のヘパリン
、フィルタリング滅菌し、4℃で保存します。 - 顕微鏡を準備します。
- 流出の場合には保護用のプラスチックラップと顕微鏡のベースカバーに入る。
- ラップの上に紙タオルを置く。手術台にはペーパータオルの上に座ります。
- 手術台の表示やスポンジに焦点を当ててピントを事前に調整する。
- 魚の重量を量る。
- 魚の放熱水との完全な約1 / 3 500mLのビーカーを埋める。
- 天びんをテア。
- ネットを使って魚を集める。離れて簡単にペーパータオルの上でネットを軽くたたくことによってネットと魚から余分な水分を放出する。ビーカーに魚を移す。
- 魚の重量を量る。
- きれいな水槽に魚を移す。
- 独自のラベルが付いたタンクにそれぞれ秤量した魚を移す。
- 魚の重量に基づいて、それぞれの魚のための注入量を計算する。
- 注射器と関連する噴射装置を準備します。注射のために、我々は35G斜めのスチール針と10μlのNanoFilのマイクロシリンジをお勧めします。製造元の指示に従ってNanoFilシリンジとsilflexチューブを準備します。注射器とチューブからの気泡を除去することが重要です。注射器とチューブを充填した後、ポンプにシリンジをマウントして、プログラムは最初に魚のための注入量を。
- 手術台を準備します。
- それは高さが約20mmになるように柔らかいスポンジを（そのような＃L800 - D、Jaece産業など）をカット。平らな面に、深さ10〜15ミリメートルであるカットを行います。このカットは、注射のために魚を保持するトラフです。
- 60ミリメートルペトリ皿にスポンジを設定します。
- 適切なサイズのピペットチップボックスの蓋にスポンジでシャーレを設定します。蓋は、スポンジの温度を維持するために水を保持するのに十分な大きさでなければなりませんが、それが邪魔にしないように十分な浅いはずです。我々は11.4センチメートルL X 7.7センチメートルW × 1.5 cmのP200チップボックスから蓋を使用してD.
- 麻酔薬を準備します。
- 魚の施設の水から作られたキューブを使用して砕いた氷を作る。
- 砕いた氷できれいな氷のバケツをいっぱいに。
- このような2.4リットルラバーメイドの食品保存容器などの大型コンテナに手術台を置く。
- 外側のコンテナと手術台にいくつかの施設の水を（暖かい）注ぐ。暖かい放熱水の予備を近くにしてください。
- 外側の容器の中に温度計を置く。
2。麻酔、注射およびリカバリ
- 麻酔外側のコンテナに加えて顕微鏡に隣接して手術台に置きます。近くの氷片のバケツを持っている。
- 17に水の温度を下げる° Cの氷のチップを追加することによって。重要：このステップでは17℃以下にしないで下さい。
- 外側の容器に魚を転送するためにネットを使用してください。
- 徐々に12に温度を下げるために容器に氷片を追加° C、数分間にわたり。
- モニターの魚の挙動：17℃で、またはわずかに低く、魚は一般的に、水平に胸ひれを広げ息を呑む、および迅速な蓋の動きを持っているでしょう。温度が下がると、魚が泳いで停止し、よりゆっくりと最終的に泳ぐになります。麻酔の外科的平面に近づくにつれて、喘ぎが停止し、蓋の動きが遅くなります。それが処理さに反応しないときに魚が注射の準備ができています。ほとんどの魚、12℃の場合はCで十分です。大きい魚は寒いWAが必要な場合がありますTER。
- 必要な温度（〜12 ° Cまたは寒い）に達しているとして、それを飽和させるためにスポンジを押してください。
- 彼らは魚をウォームアップし、取扱い中に麻酔からそれを持っていないことを充分に冷たい水に指を近づけないでください。
- 冷たい指で、軽くスポンジの谷に魚を移す。トラフの上腹部や鰓で魚を置きます。
- 迅速顕微鏡ステージに手術台を転送する。
- 素早く作業を、慎重に骨盤のフィンの間の正中線に針を挿入する。針は頭側で示す必要があり、肛門にも近い骨盤に挿入される。あなたは、針が体壁に深いときに感じることができるはずです。適切な量を注入し、針を撤回。
- 注入後、直ちにその温水タンクの水を介しスポンジから魚を解放することによって、リカバリ用（〜28.5 ° C）タンクに戻し、魚を移す。
ヒント：魚はすぐに水泳開始されない場合、それは静かに鰓に向かって水を旋回して回復を助ける。 - 針を確認してください。時折スケールが取り付けられてもよいし、次の注入の前に削除する必要があります。
- その後の注射の場合は、° C、次の魚を導入する前に17に戻すまでの麻酔チャンバーの水の温度を持って暖かい施設の水を使用してください。
3。代表的な結果：
図1は0.5mg / gのグルコースまたは車両の腹腔内注射後の代表的な結果。魚は、注射前72時間絶食させた。 x軸は時間、ポスト噴射を示しています。 ± SEMを意味する。
Discussion
空腹時、ひょう量、麻酔、注射、および回復：腹腔内注射は、5つのステップが含まれます。各ステップの成功を確保することができるベストプラクティスがあります。成功は、健康な魚の患者だけでなく、良い実験結果が含まれています。
空腹時：24時間の高速は、腸の電球を空にする必要があります。このような行為は、魚獣医文献（例えば、ブラウン1993）から取得されます。追加の空腹時の考慮事項について以下に説明します。
長期的な断食：私たちは、72時間高速で注入する前にベースラインレベルに血糖を減少させるために必要であることを発見した（イームズら 、2010）。我々はまた、グルコースの研究のために魚が適切に絶食していることを保証するために必要とされるいくつかの手順があることを発見した。クリーンタンク（底のない破片）で始まります。タンクは明らかに"断食"というラベル、オフライン状態にしてください、そして場所に熱狂的な魚の医療従事者はそれらを給紙されない場所。タンクの外部環境を評価し、ストレスは血糖を上げるために知られているように、障害から強調されてから魚をしないように対策を講じる（チャビンとヤング、1970;グロッフら 、1999。）。例えば、我々は無線は魚のタンクを持っていたベンチに毎日運営された断食実験していた。我々は、血糖値が異常に高いことが判明し、魚が振動によって強調されたと結論づけた。別のストレッサーは過密です。魚は良い魚飼育慣行に準拠して密度に維持する必要があります。推奨事項については、ブランドらを参照してください。 （2002）とウェスターフィールド（1995）。我々は、9リットルタンク（そのボリュームの一部を占めてビー玉の3層で）10〜12魚の密度で私たちの魚を絶食良い結果を得ています。男女を分離することがストレスの原因となりますので、高速の中に混在性別人口を維持することをお勧めします。これは、卵を配置することができることを意味し、そして卵は、それらが食べされないように隔離する必要があります。卵を隔離するための簡単な方法は、大理石の2-3層でタンクの底をカバーするものである。水質は、卵や廃棄物を除去することによって、毎日水槽の水の約10-15％を、置き換えることにより維持される必要があります。サイフォン、卵や廃棄物を除去するに適しています。
ひょう量：麻酔ではない魚を計量するとき、注意が正確な計量を確保するために、ビーカーにネットから水の移動を最小限に抑えるよう注意が必要です。ネットが（魚付き）ペーパータオルにブロットされている場合、余分な水分の大部分は除去することができ、重量を正確に測定することができる。それは前の計量に魚を麻酔する方が簡単かもしれませんが、私たちは一日に二度魚を麻酔の可能性のある影響をテストしていません。我々は、それが麻酔され、ゆっくりと乾燥したブロットした後、魚を再び秤量しネッティング/ブロッティング法を持つ最初の魚を秤量し、ことによって私たちの技術をテストしている。我々は、メソッド間の体重に有意差は認められなかった（P = 0.7927、t -検定）。さらに、我々は、単にとすぐに（なしブロッティング）網掛けされているビーカーに魚を移すと比較して、このネッティング/ブロッティング法、影響を受けた血糖かどうかを試験した。我々は2つの転送方法との間の血糖値に有意差は認められなかった（P = 0.2241、t -検定）。
麻酔：化学麻酔は、多くの研究に適している。多くの麻酔薬は、（tricaine/MS-222（ブラウン、1993）を含む）、血糖値を上げるので、ここでは、代替手段として、冷たい水の麻酔を実証した。以前の研究では、私たちは冷たい水が（イームズら 、2010）ゼブラフィッシュで血糖値を上昇させないことを決定した。
冷たい水の麻酔の場合は、温度を徐々に減少させるべきである。減少率は小さい魚が大きな魚よりも高速で行くと、魚の大きさに依存するようです。注入に続いて、魚は麻酔薬（下記参照）から、あまりにもゆっくりと回復していることが観察される場合があります。開始温度が低すぎる場合、または温度があまりにも急激に減少しているときにどちらかこれが発生する可能性があります。開始温度は、水に入ると魚が曲がる場合横方向に低すぎる。開始温度が正しければ、魚は最初にそのバランスを維持します。それは、水平の位置にその胸ひれを回して息をのむ、および迅速な蓋の動きを持つことになります。一般的に、それは泳ぐだろう。温度が減少すると、動きが減少し、魚は平衡を失うことになる。魚が反応することなく処理できるときに麻酔の外科平面に到達する。手術の麻酔下で魚を維持するために、あなたの指は、寒くなるので、魚を処理する前に水でそれらを維持する必要があります。スポンジは、魚を麻酔に使用される水と同じ温度で低温に保たれている必要があります。 sufficieである水とスポンジを飽和することが重要です。魚はその上に配置されると、麻酔を維持するためにntly寒い。
注射：前着手注射に、あなたが体壁の厚さの感覚を得るために少なくとも1つの魚を解剖したい場合があります。これは、針が腹腔を入力するように挿入する必要がどこまで判断することができます。さらに、針を挿入するように、針が腹腔内に入ると体壁は、"与える"感じることができる。注入中に、患者を満足させるための手順を実行します。スポンジを注入中に復活するから魚を防ぐために、正しい温度冷たい水で飽和されていることを確認します。よく飽和と柔らかいスポンジは、スケールと、皮膚の被覆粘液へのダメージを最小にするために重要です。よく飽和スポンジはエラが通気保つためにも重要です。我々は、非常に材料の下に、下記のフォームスポンジをお勧めします。最後に、一度魚が麻酔か、魚が下になる時間を最小限に抑えるために迅速に働く。
回復：魚は暖かい水槽の水に入ると実質的に麻酔から回復する必要があります。魚はえらに向かって静かに渦巻く水の回復を高速化するために、すぐに水泳を開始していない場合。回復が遅い場合は、その後、魚が余りにすぐに下に行き、あなたが適切に麻酔の手順を調整する必要があります。緩やかな回復の可能性のある原因は、麻酔下で説明されています。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、糖尿病および消化器の国立研究所と腎臓病による青少年糖尿病研究財団の助成金5-2007-97（VEPに）、によってサポートされていました助成金R01DK064973（VEPに）、R01DK48494（LHPに）、T32DK07074（SCEをサポート）、K01DK083552 （MDKに）、そしてシカゴの糖尿病研究研修センターの大学にP60DK20595で。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIDDKまたはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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