Summary
우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal 주사를 보여줍니다. 우리는 Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump III에 의해 통제 10 μl NanoFil microsyringe을 사용합니다. 이 예제는 마취로 찬물의 사용을 포함합니다.
Abstract
화학적 zebrafish 치료를위한 편리한 방법은 그것이 물고기에 의해 촬영되는 탱크 물에 시약을 소개하는 것입니다. 그러나,이 방법은 어려운 시약을 흡수 또는 물고기 당 최대 촬영 어느 정도 알고 있습니다. 신진 대사 연구 특히 이들과 관련된 몇 가지 실험 질문은, 더 나은 무게에 따라 각 물고기에 정의된 수량을 제공함으로써 해결될 수 있습니다. 여기 우리는 성인 zebrafish에 intraperitoneal (IP) 주입을위한 방법을 제시한다. 사출은 복강에 골반 환상 골에 후부 있습니다. 이 절차는 큰 물고기에 사용되는 동물의 적응 방법이다. 우리가 제로 사망률을 관찰 것처럼 그것은 안전합니다. 또한, 우리는 127 주사의 단 5 밖에서 주입 사이트에서 출혈이 볼 수 있고,이 경우 각각의 출혈이 간단한, 지속적인 몇 초 정도 있었고, 분실 혈액의 수량이 작은되었습니다. 이 절차와 성공, anesthetizing, 사출 및 복구 무게, 금식 등 여러 단계를 통해 물고기의 부드러운 핸들링이 필요합니다. 주의 사항이 절차를 통해 스트레스를 최소화하기 위해 필요합니다. 우리의주의는 작은 분사 볼륨 및 35G 바늘을 사용하여 포함됩니다. 우리는 osmotically 민물고기에 대한 균형있는 차량으로 코트 랜드 소금 솔루션을 사용합니다. 아가미의 폭기는 사출 자체 동안 물이 포화 스폰지 내의 여물 물고기를 누른 먼저 느린 operculum의 움직임을 허용 마취 수술 비행기로 물고기를 가져다하여 사출 과정 동안 유지하고, 두번째입니다. 우리는 포도당을 주입하고 혈당 수준의 상승과 정상의 후속 수익을 모니터링하여 IP 주입의 유틸리티를 보여줍니다. 스트레스가 teleost 물고기의 혈당을 증가하는 것으로 알려져 있습니다, 우리는 차량 주입 및 비 주입 성인 혈당 수준을 비교하고 절차는 혈당에 큰 상승을 발생하지 않는 것으로 나타났습니다.
Protocol
1. 사전 분사 준비
- 이전 주사 최소한 24 시간 동안 빠른 물고기. 이것은 장내 전구 (위) 내용을 비어있는 것입니다. 기본 금식 프로토콜은 깨끗한 탱크에 그들의 정상적인 밀도에서 물고기를 전송하는 것입니다, 다음 음식을 보류. (예 : 혈당 연구에 대한) 더 엄격한 조건을 필요로 장기 금식은 토론에 추가 고려 사항을 참조하십시오.
- 코트 랜드 소금 솔루션 (페리 외., 1984)를 준비합니다.
100 ML 볼륨의 경우, 증류수에 다음을 해산 :
725 MG NaCl (124.1 ㎜)
38 MG KCl (5.1 ㎜)
41 MG 나 2 HPO 4 (2.9 ㎜)
24 MG MgSO 4 7H 2 O ∙ (1.9 ㎜)
16 MG CaCl 2 ∙ 2 시간 2 O (1.4 ㎜)
100 MG NaHCO 3 (11.9 ㎜)
4g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4 %)
1,000 USP 단위 헤파린
, 필터 소독 및 저장 4 ° C. - 현미경을 준비합니다.
- 유출의 경우 보호를 위해 플라스틱 랩과 현미경 기지를 커버.
- 플라스틱 랩 위에 종이 타월을 넣어. 외과 테이블은 종이 타월 위에 앉아 것입니다.
- 사전 조정 수술 테이블을보고 스폰지에 초점을 맞춤으로써 초점을.
- 물고기의 무게를.
- 1 / 생선 시설 물로 가득 약 3 500 ML의 비커를 입력합니다.
- 테어 균형.
- NET을 사용하여 물고기를 수집합니다. 멀리 간단히 종이 타월에 그물을 dabbing하여 그물과 물고기에서 초과 물을 윅. 비커에 생선을 전송합니다.
- 물고기의 무게를.
- 깨끗한 수조에 물고기를 전송합니다.
- 자체 분류 탱크에 각각 무게 생선을 전송합니다.
- 생선 무게에 따라 각각의 물고기에 대한 사출 볼륨을 계산합니다.
- 주사기 및 관련 사출 장비를 준비합니다. 주입을 위해, 우리는 35G beveled 강철 바늘과 10 μl NanoFil의 microsyringe을 권장합니다. 제조 업체의 지침에 따라 NanoFil 주사기와 silflex 튜브를 준비합니다. 주사기와 튜브의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다. 주사기와 튜브를 작성 후, 펌프에 주사기를 탑재하고, 프로그램의 첫 번째 물고기에 대한 사출 볼륨을.
- 수술 테이블을 준비합니다.
- 그것이 높이 약 20mm가되도록 부드러운 스폰지 (예 : # L800 - D, Jaece 산업 등) 잘라. 평면 얼굴에 깊은 10-15mm있는 상처를 확인하십시오. 이 상처는 분사를 위해 물고기를 개최합니다 구유입니다.
- 60mm 페트리 접시에 스폰지를 설정합니다.
- 적절한 크기의 피펫 팁 상자 뚜껑에 스펀지와 페트리 접시를 설정합니다. 뚜껑은 스폰지 온도를 유지하기 위해 물을 잡아 충분히 크게해야하지만, 그것은 방해하지 않도록 충분히 얕은해야합니다. 우리는 11.4 cm X 7.7 cm L W X 1.5 cm입니다 P200 팁 상자에서 뚜껑을 사용 D.
- 마취를 준비합니다.
- 생선 설비 물로 만들어진 큐브를 사용하여 얼음 조각을 만듭니다.
- 얼음 조각과 함께 깨끗한 얼음 양동이를 채우십시오.
- 같은 2.4 리터 Rubbermaid 식품 저장 용기로 큰 용기에 수술 테이블을 넣어.
- 바깥쪽 컨테이너와 수술 테이블에 어떤 시설 물 (따뜻한) 하거라. 따뜻한 물 시설의 보유를 근처 유지.
- 외부 컨테이너에 체온계를 넣어.
2. 마취, 분사 및 복구
- 마취 바깥쪽 컨테이너 플러스 현미경에 인접한 외과 테이블을 배치합니다. 근처의 얼음 칩 버킷 있습니다.
- 17 물의 온도를 내려줘 ° C 얼음 조각을 추가하여. 중요 :이 단계 17 ° C 아래에 가지 마세요.
- 외부 컨테이너에 물고기를 전송하는 그물을 사용합니다.
- 천천히 12 온도를 넘어뜨리고 ° C, 몇 분의 과정을 통해. 용기에 얼음 조각을 추가
- 모니터 생선 동작 : 17 ° C 또는 약간 낮은 물고기가 일반적으로 가로의 가슴 지느러미를 확산 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 온도가 방울로, 물고기가 수영을 중지 더 느리게 그리고 마지막으로 수영합니다. 마취의 수술 비행기가 가까이이므로이 온다 중지하고 operculum의 움직임은 천천히합니다. 그것이 처리되는 반응하지 않는 경우 물고기 주입을위한 준비가 된 것입니다. 대부분의 생선, 12 ° C가 충분합니다. 큰 물고기는 추운 WA 필요할 수 있습니다터.
- 필요한 온도가 포화에 스펀지에 (~ 12 ° C 또는 추워), 언론에 도달 때문입니다.
- 그들은 물고기를 따뜻하게하고 처리하는 동안 마취를 꺼낼 수가없는 것입니다 충분히 있으므로 찬물에 손가락을 유지.
- 차가운 손가락으로 부드럽게 스펀지의 여물에 생선을 전송합니다. 여물에 복부와 아가미와 함께 물고기를 놓습니다.
- 신속 현미경 단계에 수술 테이블을 전송합니다.
- 신속하게 작업, 신중하게 골반 지느러미 사이의 정중선에 바늘을 삽입합니다. 바늘은 cranially 가리 켜야하고 항문에보다 가깝게 골반 환상 골을 삽입할 수 있습니다. 당신은 바늘이 몸을 벽에 깊이 때 느낄 수있을 것입니다. 적절한 볼륨을 삽입하고 바늘을 철회.
- 주입 후, 즉시의 따뜻한 물 (~ 28.5 ° C) 탱크 물 위에 스펀지에서 물고기를 발표하여 복구를위한 탱크. 다시 물고기를 전송
팁 : 물고기가 즉시 수영을 시작하지 않는 경우, 부드럽게 아가미쪽으로 물이 소용돌이로 복구하는 데 도움이됩니다. - 바늘을 확인합니다. 간혹 규모가 첨부된 수 있으며 다음 주사하기 전에 제거되어야합니다.
- 이후 주사 들어, ° C 다음 생선을 도입하기 전에 17 백업 마취 챔버 물 온도를 가지고 따뜻한 설비 물을 사용합니다.
3. 대표 결과 :
그림 1. 0.5 MG / G 포도당이나 차량의 intraperitoneal 주사를 다음과 같은 대표적인 결과. 생선 주입하기 전에 72 시간 금식했다. x 축은 시간 후 주사를 보여줍니다. ± SEM을 뜻합니다.
Discussion
Intraperitoneal 주사 다섯 단계를 포함 : 금식 계량, 주입, 및 복구를 anesthetizing. 각 단계의 성공을 보장할 수 모범 사례가 없습니다. 성공은 건강한 물고기 환자뿐만 아니라 좋은 실험 결과를 포함하고 있습니다.
금식 : 24 시간 빠른이 장의 전구 비어해야합니다. 이러한 행위는 물고기 동물 문학 (예 : 브라운 1993)에서 발췌한 것입니다. 추가 금식 고려 사항은 아래 설명합니다.
장기 금식 : 우리는 72 시간 빠른하기 전에 주사하는 기본 수준으로 혈당을 감소하는 데 필요한 것으로 나타났습니다 (임스 외, 2010.). 우리는 또한 포도당 연구 물고기가 제대로 금식되는 것을 보장하기 위해 필요한 몇 가지 절차가있다는 것을 발견했습니다. 깨끗한 탱크 (바닥에 부스러기없이)로 시작합니다. 탱크는 명확하게 '금식'으로 분류, 오프라인되어야하고, 위치에 열정 생선 관리 직원이 그들을 먹여 살리지하지 않습니다 어디에. 탱크의 외부 환경을 평가하고 스트레스가 혈당 (Chavin 영, 1970.; 그로프 외, 1999)을 마련하는 것으로 알려져으로 교란에서 강조되는 물고기를 방지하기위한 조치를 취할. 예를 들어, 우리는 라디오가 물고기 탱크를 들고 있던 벤치에서 매일 운영어진 금식 실험을했다. 우리는 혈당이 비정상적으로 높은이고 물고기는 진동에 의해 강조되었다 결론 발견했습니다. 또 다른 스트레스가 사람을 너무 많이들이는 것입니다. 생선 좋은 생선 축산 관행과 준수 밀도에 보관해야합니다. 추천, 브랜드 외를 참조하십시오. (2002 년)와 웨스 터 (1995). 우리는 9리터 탱크 (해당 볼륨의 일부를 차지하지 구슬 3 레이어)에 10-12 물고기의 밀도에 우리 생선 금식 좋은 결과를 있었다. 남녀를 분리하는 것은 스트레스의 원인이 될 수 있습니다, 그래서 우리는 빠른 동안 혼합 성별 인구를 유지하는 것이 좋습니다. 이것은 계란이 여자랑 수있다는 것을 의미하고, 계란 그들이 먹지 않을 수 있도록 분리된해야합니다. 달걀을 격리하는 간단한 방법은 구슬로부터 2-3 레이어와 탱크 바닥을 커버하는 것입니다. 수질은 계란과 쓰레기를 제거하여 매일 탱크의 물을 10-15 % 정도를 교체하여 유지되어야합니다. 몰래 빼내고, 계란과 쓰레기를 제거 잘 작동합니다.
무게 : anesthetized되지 않은 생선 무게 경우, 치료는 정확한 계량을 보장하기 위해, 비커에 그물에 물을 전송을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 그물은 (생선) 종이 타올에 blotted 경우, 초과 물의 대부분은 제거할 수 있으며 무게는 정확하게 측정할 수 있습니다. 그것은 전에 무게로 물고기를 마취하기 쉬울 수 있지만, 우리는 하루에 두 번 생선을 anesthetizing의 가능한 효과를 테스트하지 않았습니다. 우리는 anesthetized 후 다시 무게 물고기 다음 그물 / 방법을 모래 바닥과 함께 먼저 생선을 무게로 우리의 기술을 테스트하고, 부드럽게 건조 blotted있다. 우리는 방법 사이의 무게에 큰 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.7927, T - 테스트). 또한, 우리는이 그물 /가 (NO 모래 바닥) netted이므로 단순히 즉시 비커에 생선을 전송에 비해, 방법에 영향을 혈당을 모래 바닥 여부를 테스트했습니다. 우리는 두 가지 전송 방법 사이의 혈당 수준에 상당한 차이를 찾을 수 없습니다 (P = 0.2241, T - 테스트).
Anesthetizing : 화학 마취 많은 연구에 적합한 수 있습니다. 많은 anesthetics이 (tricaine/MS-222 (브라운, 1993)를 포함), 혈당을 올리기 때문에 여기에서 우리는 대안으로 냉수 마취를 증명하고있다. 이전 연구에서, 우리는 차가운 물 (임스 외., 2010) zebrafish에서 혈당을 인상하지 않는 것으로 나타났습니다.
콜드 워터 마취의 경우, 온도가 천천히 감소한다. 감소의 비율은 작은 물고기가 큰 물고기보다 아래에가는과 함께 물고기의 크기에 따라 달라 보인다. 분사에 따라, 당신은 물고기 (아래 참조) 마취에서 너무 느리게 회복 것을 관찰할 수 있습니다. 시작 온도는 온도가 너무 빠르게 감소합니다 너무 낮은 경우 또는 경우 중이 발생할 수 있습니다. 시작 온도는 물을 입력시 생선 숨어 경우 옆으로 너무 낮습니다. 시작 온도가 맞다면, 물고기는 처음의 균형을 유지합니다. 그것은 수평 위치는 가슴 지느러미를 회전 말하다하고, 빠른 operculum의 움직임을 것입니다. 일반적으로, 그것은 수영을합니다. 온도 감소로, 움직임이 저하되고 물고기는 균형을 잃게됩니다. 물고기가 반응하지 않고 처리할 수있을 때 마취의 수술 비행기에 도달입니다. 외과 마취 물고기를 유지하기 위해, 손가락, 추울 때문에 생선을 취급하기 전에 물에 보관해야합니다. 스폰지는 또한 물고기를 anesthetizing에 사용되는 물 같은 온도에서 추위 보관해야합니다. sufficie는 물로 스폰지를 포화하는 것이 중요하다물고기가 그것에 배치되면 마취를 유지하는 ntly 감기.
사출 : 이전 사업 주사로, 당신이 신체 벽 두께의 감각을 얻으려면 적어도 하나의 물고기를 해부하다 할 수 있습니다. 이것은 바늘이 복강를 입력 삽입할 필요가 얼마나 멀리 당신이 판단하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 당신이 주사 바늘을 삽입으로, 당신은 바늘이 복강를 입력하면 신체 벽은 "줄"느낄 수 있습니다. 주사하는 동안 환자가 행복하게하기위한 조치를 취할. 스폰지가 주입하는 동안 되살리는에서 물고기를 방지하기 위해 정확한 온도 차가운 물로 포화되어 있는지 확인하십시오. 잘 포화 부드러운 스펀지는 비늘과 피부의 커버 가래의 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 잘 포화 스펀지는 아가미가 aerated 유지에도 중요합니다. 우리는 높은 재료 아래에 나열된 거품 스폰지를 권장합니다. 마지막으로, 일단 물고기가 anesthetized이며, 물고기가 아래에되는 시간을 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다.
복구 : 물고기가 거의 따뜻한 물 탱크를 입력시 마취에서 회복한다. 물고기는 회복 속도는 아가미쪽으로 소용돌이 물을 부드럽게, 즉시 수영을 시작하지 않으면. 복구가 느리다면, 물고기가 너무 빨리 아래에 가서 당신은 적절하게 마취 절차를 조정해야합니다. 느린 회복의 원인은 Anesthetizing 아래에 설명합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
본 연구는 당뇨병과 소화 국립 연구소 신장 질환으로 소아 당뇨병 연구 재단 부여 5-2007-97 (VEP)을, 지원했다 보조금 R01DK064973 (VEP)를, R01DK48494 (LHP)를, T32DK07074 (SCE을 지원), K01DK083552 (MDK)를, 그리고 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터의 대학에 P60DK20595로. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDDK 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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