Summary
Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.
Abstract
Um método conveniente para tratar quimicamente zebrafish é introduzir o reagente na água do tanque, onde será absorvido pelos peixes. No entanto, este método torna difícil saber o quanto de reagentes é absorvido ou tomado por peixe. Algumas perguntas experimental, particularmente aqueles relacionados aos estudos metabólicos, pode ser melhor abordados através da apresentação de uma quantidade definida para cada peixe, com base no peso. Aqui apresentamos um método para injeção (IP) intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Injeção é na cavidade abdominal, posterior à cintura pélvica. Este procedimento é uma adaptação de métodos veterinários utilizados para peixes maiores. É seguro, como temos observado mortalidade zero. Além disso, temos visto sangramento no local da injeção em apenas 5 de 127 injeções, e em cada um desses casos, o sangramento foi breve, durando vários segundos, ea quantidade de sangue perdido era pequeno. Sucesso com este procedimento requer manuseio suave dos peixes através de várias etapas, incluindo o jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Precauções são necessárias para minimizar o estresse durante o procedimento. Nosso precauções incluem o uso de um volume de injeção de pequeno e uma agulha 35G. Usamos Cortland solução salina como o veículo, que é osmoticamente balanceada para peixes de água doce. Aeração das brânquias é mantida durante o procedimento de injeção pela primeira trazendo o peixe em um plano cirúrgico de anestesia, o que permite movimentos opérculo lento e, segundo, mantendo os peixes em um canal dentro de uma esponja saturada de água durante a injeção em si. Nós demonstrar a utilidade da injeção IP através da injeção de glicose e monitorar a elevação do nível de glicose no sangue e seu posterior retorno ao normal. Como o stress é conhecido por aumentar a glicose no sangue em peixes teleósteos, comparamos os níveis de glicose no sangue em adultos veículo injetado e não injetados e mostrar que o procedimento não causa um aumento significativo da glicose no sangue.
Protocol
1. Pré-injeção Preparações
- Rápido o peixe por pelo menos 24 horas antes da injeção. Isto irá esvaziar o bulbo intestinal (estômago) conteúdo. O protocolo de jejum básica é a de transferir o peixe, a sua densidade normal, para um tanque limpo, então reter o alimento. Para longo prazo jejum que exigir condições mais rigorosas (por exemplo, para estudos de glicose no sangue), ver considerações adicionais na discussão.
- Prepare Cortland solução salina (Perry et al., 1984).
Para um volume de 100 mL, dissolver o seguinte em água destilada:
725 mg de NaCl (124,1 mM)
38 mg KCl (5,1 mM)
41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mM)
24 mg MgSO 4 7H 2 O ∙ (1,9 mM)
16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mM)
100 mg NaHCO 3 (11,9 mM)
4 g Polivinilpirrolidona (PVP) (4%)
1000 unidades de Heparina USP
Filtro, esterilizar e armazenar a 4 ° C. - Prepare o microscópio.
- Cobrir a base do microscópio com filme plástico para proteção em caso de derramamentos.
- Coloque uma toalha de papel em cima do plástico. A mesa cirúrgica vai sentar em cima da toalha de papel.
- Pré-ajustar o foco através da visualização da mesa cirúrgica e incidindo sobre a esponja.
- Pesar o peixe.
- Encher um copo de 500 ml cerca de 1 / 3 cheio com água instalação de peixe.
- Tare a balança.
- Recolher o peixe usando uma rede. Wick o excesso de água longe da net e peixes, por breves instantes dabbing o líquido sobre papel absorvente. Transfira o peixe para o copo.
- Pesar o peixe.
- Transferir os peixes para um tanque limpo.
- Transferência de cada peixe pesava a seu próprio tanque rotulados.
- Calcular o volume de injeção para cada peixe com base no peso dos peixes.
- Prepare a seringa e equipamento de injeção relacionados. Injectável, recomendamos uma 35G agulha de aço chanfrada a 10 micro e NanoFil mL. Prepare a seringa NanoFil e tubos silflex seguindo as instruções do fabricante. É importante para eliminar as bolhas da seringa e tubos. Após o preenchimento da seringa e tubulação, monte a seringa na bomba, e programar o volume de injeção para o primeiro peixe.
- Prepare a mesa cirúrgica.
- Cortar uma esponja macia (como # L800-D, Jaece Industries), de modo que é de aproximadamente 20 mm de altura. Na face plana, faça um corte que é de 10-15 mm de profundidade. Este corte é a calha que vai segurar o peixe para injeção.
- Definir a esponja em uma placa de Petri 60 mm.
- Definir a placa de Petri com esponja em uma de dimensões adequadas e tampa da caixa ponta da pipeta. A tampa precisa ser grande o suficiente para armazenar água para ajudar a manter a temperatura esponja, mas deve ser rasa o suficiente para não ficar no caminho. Usamos uma tampa de uma caixa de ponta P200 que é 11,4 centímetros L x 7,7 centímetros W x 1.5 cm D.
- Prepare o anestésico.
- Fazer gelo picado usando cubos feitos de água instalação de peixe.
- Encher um balde de gelo limpo com o gelo picado.
- Colocar a mesa cirúrgica em um recipiente maior, como um Rubbermaid 2,4 litros recipiente de armazenamento de alimentos.
- Despeje um pouco de água facilidade (quente) para o recipiente externo e mesa cirúrgica. Manter uma reserva de água quente instalações nas proximidades.
- Coloque um termômetro dentro do recipiente externo.
2. Injeção de anestesia e recuperação
- Coloque o recipiente anestésico exterior com mesa cirúrgica ao lado do microscópio. Tem o balde de cubos de gelo nas proximidades.
- Traga a temperatura da água até 17 ° C pela adição de pedaços de gelo. Importante: Não vá abaixo dos 17 ° C para esta etapa.
- Use uma rede para transferir o peixe para o recipiente exterior.
- Lentamente, adicionar pedaços de gelo ao recipiente para baixar a temperatura a 12 ° C, ao longo de vários minutos.
- Monitorar o comportamento dos peixes: Aos 17 ° C ou ligeiramente abaixo, o peixe tipicamente espalhará seus nadadeiras peitorais horizontalmente, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Quando a temperatura cai, os peixes vão nadar mais lentamente e, finalmente, parar de nadar. Como o plano cirúrgico de anestesia é abordado, ofegante vai parar e movimentos opérculo será lenta. O peixe está pronto para a injecção quando não reage a ser tratada. Para a maioria dos peixes, 12 ° C é suficiente. Peixes maiores podem exigir mais frio water.
- Como a temperatura desejada é atingida (~ 12 ° C ou mais frio), pressione a esponja para saturá-lo.
- Mantenha seus dedos na água fria o suficiente para que eles não vão aquecer o peixe e trazê-lo para fora de anestesia durante o manuseio.
- Com dedos frios, gentilmente transferir o peixe para a calha da esponja. A posição do peixe com o abdômen para cima e as brânquias no cocho.
- Transferir rapidamente da mesa cirúrgica para o palco microscópio.
- Trabalhando rapidamente, insira cuidadosamente a agulha no midline entre as nadadeiras pélvicas. A agulha deve apontar cranialmente e ser inserido mais perto da cintura pélvica do que do ânus. Você deve ser capaz de sentir quando a agulha é profunda para a parede do corpo. Injetar o volume adequado e retire a agulha.
- Após a injeção, transferir imediatamente os peixes de volta à sua água morna (~ 28.5 ° C) tanque de recuperação, libertando o peixe da esponja sobre a água do tanque.
Dica: Se o peixe não começa imediatamente natação, ajudá-la a recuperar rodando suavemente água para as brânquias. - Verifique a agulha. Ocasionalmente, uma escala pode ser anexado e deve ser removido antes da próxima injeção.
- Para injecções subsequentes, use água morna facilidade para trazer o anestésico temperatura da água câmara de volta até 17 ° C antes de introduzir os peixes próximos.
3. Resultados representativos:
Figura 1. Seguintes resultados Representante injeção intraperitoneal de 0,5 mg de glicose / g ou veículo. Peixes foram mantidos em jejum por 72 horas antes da injeção. O eixo x mostra o tempo, após a injecção. Média ± SEM.
Discussion
Injeção intraperitoneal envolve cinco etapas: jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Para cada etapa existem melhores práticas que podem garantir o sucesso. Sucesso de um paciente inclui peixes saudáveis, bem como um bom resultado experimental.
Jejum: Um jejum de 24 horas deve esvaziar o bulbo intestinal. Esta prática é tomada a partir da literatura veterinária peixe (eg, Brown 1993). As considerações adicionais de jejum são discutidos abaixo.
Longo prazo jejum: Descobrimos que um jejum de 72 horas é necessária para diminuir a glicose no sangue a um nível de base antes da injeção (Eames et al, 2010).. Temos também descobriu que, para estudos de glicose existem vários procedimentos que são necessários para garantir que os peixes estejam em jejum corretamente. Comece com um tanque limpa (sem resíduos no fundo). Tanques deve ser desligada, claramente identificados como "jejum", e em um local onde o pessoal de assistência entusiástica peixe não vai alimentá-los. Avaliar o ambiente externo do tanque e tomar medidas para evitar que os peixes de ser estressado de distúrbios, como estresse é conhecido por elevar a glicose no sangue (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Por exemplo, nós tivemos uma experiência de jejum em que uma rádio foi operado diariamente no banco que estava segurando os tanques de peixes. Descobrimos que a glicemia foi invulgarmente elevado e concluiu que os peixes estavam estressados pelas vibrações. Outro estressor é a superlotação. Os peixes devem ser mantidos a uma densidade que está em conformidade com boas práticas de peixe. Para recomendações, consulte Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Temos tido bons resultados em jejum nossos peixes com uma densidade de 10-12 peixes em um tanque de 9 litros (com 3 camadas de mármores ocupar algum desse volume). Separar os sexos pode causar estresse, por isso recomendamos a manutenção de uma população mista de sexo durante o jejum. Isto significa que os ovos podem ser estabelecidas, e os ovos precisam ser seqüestrado para que eles não serão comidos. Uma maneira simples de sequestrar ovos é para cobrir o fundo do tanque com 2-3 camadas de bolinhas de gude. Qualidade da água precisa ser mantida através da remoção de ovos e resíduos e pela substituição de cerca de 10-15% da água do tanque, diariamente. Para a remoção de ovos e resíduos, sifão funciona bem.
Pesagem: Na pesagem dos peixes que não são anestesiados, cuidados devem ser tomados para minimizar a transferência de água da rede para o copo, para assegurar uma medição precisa. Se o líquido (com peixes) é apagado em toalhas de papel, a maioria da água em excesso pode ser removido, eo peso podem ser medidos com precisão. Pode ser mais fácil para anestesiar os peixes antes da pesagem, mas não testei os possíveis efeitos de anestesiar um peixe duas vezes em um dia. Nós testamos a nossa técnica de pesagem do pescado pela primeira vez com a compensação / blotting método e, em seguida, voltando a pesar o peixe depois de ter sido anestesiados, e suavemente secos com papel absorvente. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa de peso entre os métodos (P = 0,7927, t-test). Além disso, testamos se essa compensação / blotting método de glicose no sangue afetadas, em comparação com simplesmente transferir o peixe para o copo assim que é saldada (sem blotting). Nós não encontramos nenhuma diferença significativa no nível de glicose no sangue entre os dois métodos de transferência (P = 0,2241, t-test).
Anestesiar: anestesia química pode ser adequado para muitos estudos. Aqui nós temos demonstrado anestesia água fria como uma alternativa, porque muitos anestésicos (incluindo tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentar a glicose no sangue. Em estudos anteriores, nós determinamos que a água fria não levanta de glicose no sangue em zebrafish (Eames et al., 2010).
Para anestesia água fria, a temperatura deve ser reduzida lentamente. A taxa de diminuição parece depender do tamanho do peixe, com peixes menores indo mais rápido do que em peixes maiores. Após a injeção, você pode observar que o peixe está se recuperando muito lentamente da anestesia (veja abaixo). Isto pode ocorrer quando tanto a temperatura inicial é muito baixo, ou quando a temperatura diminui muito rapidamente. A temperatura de partida é muito baixo se o peixe se dobra lateralmente ao entrar na água. Se a temperatura inicial está correto, os peixes vão manter o seu equilíbrio inicialmente. Ele irá girar suas nadadeiras peitorais para uma posição horizontal, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Normalmente, ele irá nadar. Como a temperatura diminui, os movimentos irão diminuir e os peixes vão perder o equilíbrio. Um plano cirúrgico de anestesia é alcançado quando os peixes podem ser manuseados sem reagir. Para manter os peixes sob anestesia cirúrgica, os dedos devem ser frias, por isso mantê-los na água antes de manusear o peixe. A esponja também deve ser mantido frio na mesma temperatura que a água usada para anestesiar os peixes. É importante para saturar a esponja com água que é sufficiently frio para manter a anestesia uma vez que o peixe é colocado sobre ele.
Injecção: Antes de injeções empresa, você pode querer dissecar pelo menos um peixe para ter uma noção de espessura da parede do corpo. Isso pode ajudar você para julgar o quanto a agulha precisa inserir para entrar na cavidade abdominal. Além disso, ao inserir a agulha, você pode sentir a parede do corpo "dar" quando a agulha penetra na cavidade abdominal. Durante a injeção, tomar medidas para manter o paciente feliz. Certifique-se que a esponja está saturada com a água correta temperatura fria para evitar que o peixe de reavivar durante a injeção. Uma esponja bem macia saturada e é importante para minimizar os danos às escalas e muco cobertura da pele. Uma esponja bem saturada também é importante para manter as brânquias aerado. É altamente recomendável a esponja de espuma listados abaixo em Materiais. Finalmente, uma vez que o peixe é anestesiado, trabalhar rapidamente para minimizar o tempo que o peixe está sob.
Recuperação: O peixe deve se recuperar da anestesia praticamente ao entrar no tanque de água quente. Se o peixe não começa imediatamente natação, rode suavemente a água para suas guelras para acelerar a recuperação. Se a recuperação é lenta, então o peixe passou sob muito rapidamente e você deve ajustar o procedimento de anestesia de forma adequada. As possíveis causas da lenta recuperação são discutidos sob anestesia.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation conceder 5-2007-97 (a VEP), pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concede R01DK064973 (a VEP), R01DK48494 (para LHP), T32DK07074 (apoio SCE), K01DK083552 (para MDK), e por P60DK20595 para a Universidade de Chicago e Diabetes Research Training Center. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDDK ou o NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
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