Summary
Мы демонстрируем внутрибрюшинного введения во взрослых рыбок данио. Мы используем 10 мкл NanoFil микрошприца контролируется Micro4 контроллер и UltraMicroPump III. Эта демонстрация включает в себя использование холодной воды в качестве анестезирующего средства.
Abstract
Удобный метод лечения химически данио является введение реагента в резервуар для воды, где он будет рассмотрен рыбы. Однако этот метод затрудняет знать, сколько реагента поглощается или приняты на рыбу. Некоторые экспериментальные вопросы, особенно связанные с метаболическим исследования, возможно, лучше решать путем предоставления определенного количества для каждой рыбы, в зависимости от веса. Здесь мы представляем метод внутрибрюшинного (IP) раствор для инъекций во взрослых рыбок данио. Инъекция в брюшную полость, сзади тазового пояса. Эта процедура заимствована из ветеринарных методы, используемые для крупной рыбы. Это безопасно, как мы уже наблюдали нулевой смертности. Кроме того, мы видели, кровотечение в месте инъекции только в 5 из 127 инъекций, и в каждом из этих случаев кровотечений была короткой, в течение нескольких секунд, а количество крови потерял было небольшим. Успех такой процедуры требует нежного обращения с рыбой через несколько шагов, в том числе пост, взвешивание, обезболивающее, инъекции, и восстановление. Меры предосторожности необходимы, чтобы минимизировать стресс в течение всей процедуры. Наши меры предосторожности включают использование небольшого объема инъекции и иглы 35G. Мы используем Кортленд солевой раствор, как транспортное средство, которое осмотически сбалансированным для пресноводных рыб. Аэрация жабры сохраняется во время инъекции процедуру сначала привлечения рыбы в хирургической анестезии плоскости, что позволяет медленные движения крышечкой, во-вторых, держа рыбу в корыто в насыщенном водой губкой во время инъекции себя. Мы демонстрируем полезность IP инъекции путем введения глюкозы и мониторинга роста уровня глюкозы крови и его последующее возвращение к нормальной жизни. Как стресс как известно, повышает уровень глюкозы в крови костистых рыб, мы сравниваем уровень глюкозы в крови в автомобиле с впрыском и не вводят взрослым и показать, что процедура не вызывает значительного повышения сахара в крови.
Protocol
1. Предварительно инъекционных препаратов
- Быстрый рыбы, по крайней мере за 24 часа до инъекции. Это будет пустая кишечного луковицы (желудок) содержание. Основной протокол поста заключается в передаче рыбы, по их нормальной плотности, на чистую емкость, то удерживать пищу. Для более долгосрочных поста, который требует более жестких условиях (например, для исследования глюкозы в крови), см. дополнительные соображения в обсуждении.
- Подготовка Кортленд солевой раствор (Perry и соавт., 1984).
За 100 мл объема, растворите следующие в дистиллированной воде:
725 мг NaCl (124,1 ммоль)
38 мг хлорида калия (5,1 ммоль)
41 мг Na 2 HPO 4 (2,9 мм)
24 мг MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 ммоль)
16 мг CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 ммоль)
100 мг NaHCO 3 (11,9 мм)
4 г поливинилпирролидона (ПВП) (4%)
1000 USP единиц гепарина
Фильтр, стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C. - Подготовка микроскопа.
- Обложка микроскопом базы полиэтиленовой пленкой для защиты в случае разливов.
- Поместите бумажное полотенце, сверху полиэтиленовой пленкой. Операционном столе будет сидеть на вершине бумажным полотенцем.
- Предварительно настроить фокус, просмотрев операционном столе и сосредоточение внимания на губку.
- Взвешивание рыбы.
- Заполните 500 мл стакан, около 1 / 3 полной рыбой воды объекте.
- Тара баланса.
- Сбор рыбы с помощью сети. Вика избыток воды от сети и рыбу кратко вытирать чистой на бумажных полотенцах. Передача рыбу стакан.
- Взвешивание рыбы.
- Передача рыбу чистить бак.
- Передача каждая весила рыба своим помечены танк.
- Рассчитать объемом впрыска для каждой рыбы на основе рыбы весом.
- Подготовка шприца и связанные с ними инструменты для инъекций. Для инъекций, мы рекомендуем 35G скошенной иглой стали и 10 мкл микрошприца NanoFil. Подготовка NanoFil шприц и silflex трубы в соответствии с инструкциями производителя. Важно, чтобы удалить пузырьки из шприца и трубки. После заполнения шприца и трубки, смонтировать шприц на насос, и программа объемом впрыска за первую рыбу.
- Подготовка операционном столе.
- Вырезать мягкой губкой (например, # L800-D, Jaece Industries), так что это примерно 20 мм в высоту. На плоское лицо, сделать разрез, что составляет 10-15 мм в глубину. Этот разрез корыта, который будет содержать рыбу для инъекций.
- Установить губку в 60 мм чашки Петри.
- Установите чашку Петри с губкой в подходящего размера пипетки крышкой окно кончик. Крышка должна быть достаточно большой для хранения воды для поддержания температуры губкой, но она должна быть достаточно мелко, чтобы не мешать. Мы используем крышку с наконечником P200 окно, которое составляет 11,4 см Д х Ш 7,7 см х 1,5 см D.
- Подготовка анестезии.
- Сделать дробленый лед использованием кубов из рыбы вода объекта.
- Заполните чистое ведро льда с колотым льдом.
- Положите операционном столе в емкости большего объема, таких как 2,4-литровый Rubbermaid контейнер для хранения пищи.
- Налейте немного объекта водой (теплой) во внешний контейнер и хирургический стол. Имейте запас теплой воды объекте неподалеку.
- Положите термометр в наружный контейнер.
2. Анестезия, инъекции и восстановление
- Место анестезии внешний контейнер плюс операционном столе рядом с микроскопом. Есть ведро кусочки льда поблизости.
- Доведите температуру воды до 17 ° С, добавляя кусочки льда. Важно: не опускаться ниже 17 ° С для этого шага.
- Использование сети для передачи рыбу внешний контейнер.
- Медленно добавить кусочки льда в контейнер для доведения температуры до 12 ° C, в течение нескольких минут.
- Монитор поведение рыб: при 17 ° С или чуть ниже, рыба обычно будет распространять свои грудные плавники по горизонтали, вздох, и быстрыми движениями крышечкой. Когда температура падает, рыба будет плавать медленнее и, наконец, перестать плавание. Как хирургической анестезии плоскости приближения, задыхаясь остановится и крышечки движения будут медленными. Рыба готова для инъекций, когда он не реагирует на обрабатывается. Для большинства рыб, 12 ° С является достаточной. Большие рыбы может потребовать холоднее ватер.
- Как требуемой температуры достигается (~ 12 ° С или ниже), нажмите на губку, чтобы насытить его.
- Держите пальцы в холодной воде достаточно, чтобы они не нагреются до рыбы и вывести его из наркоза во время обработки.
- С холодными пальцами, нежно передачи рыбу желоб губкой. Поместите рыбу с живота и жабры в корыто.
- Быстрый перенос операционный стол, чтобы столик микроскопа.
- Рабочие быстро, аккуратно вставить иглу в среднюю линию между брюшных плавников. Игла должна указывать краниально и быть вставлены ближе к тазового пояса, чем до ануса. Вы должны быть в состоянии чувствовать, когда игла находится глубоко, чтобы стенки тела. Inject соответствующий объем и вывести иглу.
- После инъекции немедленно передать рыбу обратно в теплой воде (~ 28,5 ° С) емкость для восстановления, выпуская рыбу из губки на резервуар для воды.
Совет: Если рыба не начинает плавание немедленно, помочь ему устранить, слегка закрученной воды к жабрам. - Проверьте иглы. Иногда масштабы могут быть приложены и должны быть удалены до следующего инъекции.
- Для последующих инъекций, используйте теплую воду объекте принести воды анестезии температуры в камере обратно до 17 ° C до введения следующей рыбы.
3. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Представителю результаты после внутрибрюшинного введения 0,5 мг / г глюкозы или транспортного средства. Рыба не кормили в течение 72 часов перед инъекцией. Ось абсцисс показывает время, после инъекции. Среднее ± SEM.
Discussion
Внутрибрюшинной инъекции состоит из пяти шагов: пост, взвешивание, обезболивающее, инъекции, и восстановление. Для каждого шага Есть рекомендации, которые могут обеспечить успех. Успех включает в себя здоровый пациент рыбы, а также хорошие экспериментальные результаты.
Пост: 24-часового голодания должен пустые кишечного лампочки. Эта практика взята из рыбы ветеринарной литературе (например, Браун, 1993). Дополнительный пост соображения будут рассмотрены ниже.
Долгосрочные поста: Мы обнаружили, что 72-часового голодания требуется для уменьшения глюкозы в крови до исходного уровня перед инъекцией (Эймс и др., 2010.). Мы также обнаружили, что для исследования глюкозы Есть несколько процедур, которые необходимы для обеспечения того, чтобы рыба постился должным образом. Начать с чистого бака (нет мусора на дне). Цистерны должны быть в автономном режиме, четко обозначены как «пост», а в месте, где энтузиазм персонала ухода рыбы не будет их кормить. Оценка внешней среды бак и принять меры по недопущению рыбы от стресса от возмущения, как стресс, как известно, повышение глюкозы в крови (Чавин и Янг, 1970;. Groff и др., 1999). Например, у нас был пост эксперимент, в котором радио выполняться ежедневно на скамейке, что держал аквариумы. Мы обнаружили, что содержание глюкозы в крови был необычайно высоким и пришли к выводу, что рыбы были подчеркнул вибрации. Другой стрессор перенаселенности. Рыба должна храниться при плотности, что соответствует передовой практике животноводства рыбы. Рекомендации см. Марка и соавт. (2002) и Уэстерфилд (1995). У нас были хорошие результаты поста нашу рыбу с плотностью 10-12 рыбу в 9 литров (с 3-мя слоями мрамора занимая часть этого объема). Разделение полов может вызвать стресс, поэтому мы рекомендуем поддержание обоих полов населения во время поста. Это означает, что яйца могут быть заложены, и яйца должны быть поглощенных так что они не будут съедены. Простой способ секвестр яиц для покрытия дна емкости с 2-3 слоями мрамора. Качество воды необходимо поддерживать путем удаления яиц и отходов и заменить около 10-15% резервуар для воды, ежедневно. Для удаления яиц и отходов, несанкционированный работает хорошо.
Взвешивания: При взвешивании рыбы, которые не под наркозом, необходимо принять меры, чтобы минимизировать переброски вод из сети в стакан, для обеспечения точного взвешивания. Если сеть (с рыбой) стирается на бумажных полотенцах, большинство избыток воды может быть удален, а вес может быть точно измерена. Это может быть проще, чтобы обезболить рыбу до взвешивания, но мы не проверяли возможные последствия обезболивающим рыбы два раза в один день. Мы протестировали нашу технику путем взвешивания рыбы сначала с сеткой / промокательной метод, а затем повторного взвешивания рыбы после того, как под наркозом, и аккуратно уничтожены сухой. Мы не обнаружили существенной разницы в весе между методами (р = 0,7927, т-тест). Кроме того, мы тестировали ли эта сетка / промокательной метод пострадавших глюкозы в крови, по сравнению с просто передача рыбы в стакан, как только это сетчатая (нет промокательной). Мы не обнаружили существенных различий в крови уровень глюкозы между двумя способами передачи (р = 0,2241, т-тест).
Обезболивающий: Химическая наркоза могут быть пригодны для многих исследований. Здесь мы показали, холодная вода анестезии в качестве альтернативы, потому что многие анестетики (в том числе tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), повышение глюкозы в крови. В предыдущих исследованиях, мы определили, что холодная вода не поднимается уровень глюкозы в крови данио (Эймс и соавт., 2010).
Для холодной воды анестезии, температура должна быть снижена медленно. Скорость убывания видимому, зависит от размера рыбы, с мелкой рыбы происходит быстрее, чем в более крупных рыб. После инъекции, вы можете заметить, что рыба идет на поправку слишком медленно после наркоза (см. ниже). Это может привести, когда либо, начиная температура слишком низкая, или когда температура снижается слишком быстро. Начальная температура слишком низкая, если рыба изгибы боков при входе в воду. Если начальная температура правильная, рыба будет поддерживать его баланс на начальном этапе. Это будет вращать свои грудные плавники в горизонтальном положении, вздох, и быстрыми движениями крышечкой. Как правило, он будет плавать. При понижении температуры, движения будет уменьшаться, а рыба будет терять равновесие. Хирургических плоскости анестезии достигается, когда рыба может быть обработано не реагируя. Для сохранения рыбы под хирургический наркоз, ваши пальцы должны быть холодными, так что держите их в воде до обработки рыбы. Губка должна быть холодным при той же температуре, как вода, используемая для анестезии рыбы. Важно, чтобы насытить губкой с водой, которая sufficiently холодной для поддержания анестезии раз рыба помещается на него.
Инъекция: До проведения инъекций, вы можете рассекать по крайней мере одну рыбу, чтобы получить чувство тела толщиной стенки. Это может помочь вам судить, насколько иглы должен вставить, чтобы войти в брюшную полость. Кроме того, как вы вставить иглу, вы можете почувствовать стенки тела "дать", когда игла попадает в брюшную полость. Во время инъекции, принимать меры, чтобы сохранить пациенту счастливой. Убедитесь, что губка насыщена правильной температуры холодной воды, чтобы предотвратить возрождение рыбы во время инъекции. Хорошо насыщенной и мягкой губкой важно для минимизации повреждения чешуи и слизи покрытие кожи. Хорошо насыщенный губки также имеет важное значение для поддержания жабры газированные. Мы настоятельно рекомендуем пена губки, перечисленные ниже по материалам. Наконец, когда рыба под наркозом, действовать быстро, чтобы свести к минимуму время, что рыба находится под.
Восстановление: рыба должна оправиться от наркоза практически при въезде в теплой воде танк. Если рыба не начинает плавание сразу, мягко водоворот воды к ее жабры, чтобы ускорить восстановление. Если восстановление идет медленно, затем рыба ушла под слишком быстро, и вы должны настроить анестезии процедуры соответствующим образом. Возможных причин медленного восстановления обсуждаются в рамках Обезболивающий.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано детского диабета исследовательский фонд грант 5-2007-97 (для ЗВП), Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний гранты R01DK064973 (для ЗВП), R01DK48494 (для КТТ), T32DK07074 (с поддержкой SCE), K01DK083552 (для MDK), а также P60DK20595 в Чикагском университете Диабет исследовательский и учебный центр. Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения NIDDK или НИЗ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
