Summary
Demostramos inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra. Nosotros usamos un 10 l microjeringa NanoFil controlado por un controlador Micro4 y III UltraMicroPump. Esta demostración incluye el uso de agua fría como un anestésico.
Abstract
Un método conveniente para tratar químicamente el pez cebra es introducir el reactivo en el agua del tanque, donde será absorbido por los peces. Sin embargo, este método hace que sea difícil saber la cantidad de reactivo es absorbido o tomado por los peces. Algunas de las preguntas experimentales, en particular los relacionados con los estudios metabólicos, pueden ser mejor atendidos por la entrega de una cantidad determinada a cada uno de los peces, en función del peso. Aquí presentamos un método para intraperitoneal (IP) la inyección en adultos de pez cebra. La inyección es en la cavidad abdominal, por detrás de la cintura pélvica. Este procedimiento es una adaptación de los métodos de uso veterinario para peces más grandes. Es seguro, como hemos observado la mortalidad cero. Además, hemos visto el sangrado en el sitio de la inyección en sólo 5 de cada 127 inyecciones, y en cada uno de esos casos, el sangrado fue breves segundos, durando varios meses, y la cantidad de sangre perdida era pequeño. Éxito con este procedimiento requiere de un manejo suave de los peces a través de varias medidas incluyendo el ayuno, con un peso, anestesia, la inyección, y la recuperación. Las precauciones son necesarias para reducir al mínimo el estrés durante el procedimiento. Nuestras precauciones incluyen el uso de un volumen de inyección de pequeñas y una aguja 35G. Usamos solución Cortland sal como el vehículo, que es equilibrada por ósmosis de peces de agua dulce. Aireación de las branquias se mantiene durante el procedimiento de inyección, en primer lugar con lo que el pescado en un plano quirúrgico de anestesia, que permite movimientos lentos opérculo, y en segundo lugar, mediante la celebración de los peces en un canal dentro de una esponja saturada de agua durante la inyección en sí. Demostrar la utilidad de la inyección de IP mediante la inyección de glucosa y el control de la elevación del nivel de glucosa en la sangre y su posterior regreso a la normalidad. Ya que el estrés se sabe que aumenta la glucosa en sangre en los peces teleósteos, se comparan los niveles de glucosa en sangre en adultos inyectados con vehículo y no inyecta-y demostrar que el procedimiento no causa un aumento significativo de la glucosa en sangre.
Protocol
1. Los preparativos pre-inyección
- Rápidamente el pescado por lo menos 24 horas antes de la inyección. Esto vaciará el bulbo intestinal (estómago) contenido. El protocolo de ayuno básica es la transferencia de los peces, a su densidad normal, a un tanque limpio, y luego abstenerse de ingerir alimentos. A más largo plazo que requiere el ayuno condiciones más rigurosas (por ejemplo, para los estudios de glucosa en la sangre), ver las consideraciones adicionales en la discusión.
- Prepare una solución de sal de Cortland (Perry et al., 1984).
Para un volumen de 100 ml, disolver el siguiente en agua destilada:
725 mg de NaCl (124,1 mM)
38 mg de KCl (5,1 mM)
41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mM)
24 mg MgSO4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM)
16 mg de CaCl 2 ∙ 2 H 2 O (1,4 mM)
100 mg NaHCO3 (11,9 mm)
4 g polivinilpirrolidona (PVP) (4%)
1,000 unidades USP de heparina
Filtro, esterilizar y almacenar a 4 ° C. - Preparar el microscopio.
- Cubra la base del microscopio con una envoltura de plástico para su protección en caso de derrames.
- Coloque una toalla de papel encima de la envoltura de plástico. La mesa de operaciones se sentará en la parte superior de la toalla de papel.
- Pre-ajustar el enfoque al ver la mesa de operaciones y centrarse en la esponja.
- Que pesar los peces.
- Llene un vaso de 500 ml aproximadamente 1 / lleno de peces de agua instalación 3.
- Tarar la balanza.
- Recoger los peces con una red. Mecha exceso de agua lejos de la red y los peces con una breve taponando la red en toallas de papel. La transferencia de los peces en el vaso.
- Que pesar los peces.
- La transferencia de los peces a un tanque limpio.
- La transferencia de cada pez pesado a su propio tanque de la etiqueta.
- Calcular el volumen de inyección para cada pez basado en el peso de pescado.
- Prepare la jeringa y equipos relacionados con la inyección. Para la inyección, se recomienda una aguja 35G de acero biselado y una microjeringa de 10 l NanoFil. Prepare la jeringa y el tubo NanoFil Silflex siguiendo las instrucciones del fabricante. Es importante eliminar las burbujas de la jeringa y el tubo. Después de llenar la jeringa y el tubo, coloque la jeringa de la bomba, y el programa del volumen de inyección para el primer pez.
- Prepare la mesa de operaciones.
- Cortar una esponja suave (como # L800-D, Jaece Industrias), de modo que es de aproximadamente 20 mm de altura. En la cara plana, hacer un corte que es de 10-15 mm de profundidad. Este corte es el canal que llevará a cabo la pesca de la inyección.
- Establecer la esponja en un 60 mm placa de Petri.
- Ajuste la placa de Petri con una esponja en una tapa de dimensiones adecuadas pipeta caja de punta. La tapa tiene que ser lo suficientemente grande como para contener el agua para ayudar a mantener la temperatura de la esponja, pero deben ser poco profundos como para no ponerse en el camino. Nosotros utilizamos una tapa de una caja de punta P200 que es de 11,4 cm de largo x 7,7 cm x 1,5 cm W D.
- Prepare la anestesia.
- Hacer uso de cubos de hielo picado a partir de peces de agua las instalaciones.
- Llenar un cubo de hielo limpio con el hielo picado.
- Ponga la mesa de operaciones en un recipiente más grande, como un contenedor de 2,4 litros de almacenamiento Rubbermaid alimentos.
- Vierta un poco de agua instalación (caliente) en el recipiente exterior y la mesa de operaciones. Mantenga una reserva de agua caliente instalaciones cercanas.
- Ponga un termómetro en el recipiente exterior.
2. Anestesia, de inyección y recuperación
- Coloque el recipiente de anestesia exterior y una mesa quirúrgica junto al microscopio. Tiene el cubo de cubitos de hielo cerca.
- Llevar la temperatura de agua a 17 ° C mediante la adición de trozos de hielo. Importante: No se vaya por debajo de 17 ° C para este paso.
- Utilice una red para la transferencia de los peces en el recipiente exterior.
- Poco a poco agregue cubos de hielo en el contenedor para bajar la temperatura a 12 ° C, en el transcurso de varios minutos.
- Monitorear el comportamiento de los peces: A los 17 ° C o ligeramente más baja, los peces normalmente se extenderá sus aletas pectorales en posición horizontal, jadear y tener movimientos rápidos opérculo. A medida que la temperatura baja, los peces nadan más lentamente y, finalmente, dejar de nadar. A medida que el plano quirúrgico de anestesia se acercó, jadeando se detendrá y los movimientos lentos opérculo. El pescado está listo para la inyección cuando no reacciona a los que se manejan. Para la mayoría de los peces, 12 ° C es suficiente. Los peces más grandes pueden requerir más frío water.
- A medida que la temperatura deseada (~ 12 ° C o inferior), pulse sobre la esponja para saturar.
- Mantenga sus dedos en el agua fría suficiente para que no se caliente el pescado y llevarlo a cabo de la anestesia durante la manipulación.
- Con los dedos fríos, con cuidado de transferencia de los peces al canal de la esponja. Coloque el pescado en el abdomen y las agallas en el comedero.
- Rápidamente la transferencia de la mesa de operaciones de la platina del microscopio.
- Trabajando rápidamente, cuidadosamente inserte la aguja en la línea media entre las aletas pélvicas. La aguja debe apuntar hacia craneal y se inserta cerca de la cintura pélvica que en el ano. Usted debe ser capaz de sentir cuando la aguja se encuentra profundamente a la pared del cuerpo. Inyectar el volumen adecuado y retirar la aguja.
- Después de la inyección, inmediatamente la transferencia de los peces de nuevo a su agua caliente (~ 28,5 ° C) el tanque de recuperación por la liberación de los peces de la esponja en el agua del tanque.
Consejo: Si los peces no comienzan a nadar inmediatamente, contribuir a su recuperación girando suavemente el agua hacia las branquias. - Compruebe la aguja. En ocasiones una escala puede estar unido y debe ser removido antes de la próxima inyección.
- Las inyecciones siguientes, el uso de agua caliente para instalaciones de llevar la cámara de anestesia temperatura del agua de nuevo hasta 17 ° C antes de introducir el pescado que viene.
3. Los resultados representativos:
Figura 1. Los resultados representativos después de la inyección intraperitoneal de 0,5 mg / g de glucosa o de un vehículo. Peces se mantuvieron en ayunas durante 72 horas antes de la inyección. El eje X muestra el tiempo, después de la inyección. Media ± SEM.
Discussion
Inyección intraperitoneal de cinco pasos: en ayunas, con un peso, anestesia, la inyección, y la recuperación. Para cada etapa existen las mejores prácticas que pueden garantizar el éxito. El éxito incluye un paciente saludable de peces, así como un buen resultado del experimento.
Ayuno: Un ayuno de 24 horas debe vaciar el bulbo intestinal. Esta práctica se ha tomado de la literatura de pescado veterinaria (por ejemplo, Brown 1993). Consideraciones adicionales en ayunas se discuten a continuación.
A largo plazo en ayunas: Hemos descubierto que un ayuno de 72 horas es necesario para disminuir la glucosa en sangre a un nivel de referencia antes de la inyección (Eames et al, 2010).. También hemos encontrado que para los estudios de la glucosa son varios los procedimientos que se requieren para garantizar que el pescado en ayuno correctamente. Comience con un tanque limpio (sin restos en la parte inferior). Los tanques deben estar fuera de línea, claramente etiquetados como "ayuno", y en un lugar donde entusiasta personal de atención de los peces no les dará de comer. Evaluar el ambiente externo de la cisterna y tomar medidas para evitar que los peces se hizo hincapié en las perturbaciones, como el estrés se sabe que aumentan la glucosa en sangre (Chavín y Young, 1970;. Groff et al, 1999). Por ejemplo, tuvimos un experimento de ayuno en la que fue operado de una radio a diario en el banco que llevaba los tanques de peces. Se encontró que la glucosa en sangre fue inusualmente alta y llegó a la conclusión de que el pescado se destacó por las vibraciones. Otro factor de estrés es el hacinamiento. El pescado debe mantenerse a una densidad que cumpla con las buenas prácticas de cría de peces. Para recomendaciones, consulte Brand et al. (2002) y Westerfield (1995). Hemos tenido buenos resultados en ayunas nuestros peces a una densidad de 10 a 12 peces en un tanque de 9 litros (con 3 capas de mármoles de tomar parte de ese volumen). La separación de los sexos puede causar estrés, por lo que se recomienda mantener una población de ambos sexos durante el ayuno. Esto significa que los huevos pueden ser puestos, y los huevos deben ser secuestrado para que no se comen. Una manera sencilla de capturar los huevos es para cubrir el fondo del tanque con 2-3 capas de canicas. La calidad del agua debe mantenerse mediante la eliminación de los huevos y los desechos y mediante la sustitución de alrededor del 10-15% del agua del tanque, todos los días. Para la eliminación de los huevos y los residuos, sifón funciona bien.
Pesaje: Al pesar los peces que no están anestesiados, se debe tener cuidado para reducir al mínimo la transferencia de agua de la red en el vaso, para garantizar la exactitud de pesaje. Si la red (con pescado) se transfirieron a las toallas de papel, la mayor parte del exceso de agua se puede quitar, y el peso se puede medir con precisión. Puede ser más fácil para anestesiar a los peces antes del pesaje, pero no hemos probado los posibles efectos de la anestesia un pescado dos veces en un día. Hemos probado nuestra técnica pesando los primeros peces con la red / secante método y volver a pesar el pescado después de haber sido anestesiado, y suavemente borrado en seco. No se encontraron diferencias significativas en el peso entre los métodos (p = 0,7927, t-test). Además, hemos probado si esta red / secante de glucosa en la sangre método afectadas, en comparación con la simple transferencia de los peces en el vaso tan pronto como se anotó (sin borrar). No se encontraron diferencias significativas en el nivel de glucosa en sangre entre los dos métodos de transferencia (P = 0,2241, t-test).
Anestesia: La anestesia química puede ser adecuado para muchos estudios. Aquí hemos demostrado anestesia agua fría como una alternativa, ya que anestésicos muchos (incluyendo tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), elevar la glucosa en la sangre. En estudios anteriores, hemos determinado que el agua fría no elevan la glucosa en la sangre en el pez cebra (Eames et al., 2010).
Para la anestesia de agua fría, la temperatura debe reducirse lentamente. La tasa de disminución parece depender del tamaño de los peces, con peces más pequeños va en más rápido que los peces más grandes. Después de la inyección, se puede observar que el pescado se está recuperando muy lentamente de la anestesia (ver más abajo). Esto puede dar lugar, cuando sea la temperatura inicial es demasiado bajo, o cuando la temperatura se reduce demasiado rápido. La temperatura inicial es muy baja si la curva de pescado lateralmente al entrar en el agua. Si la temperatura inicial es correcta, los peces mantener su equilibrio inicial. Girará sus aletas pectorales a una posición horizontal, jadear y tener movimientos rápidos opérculo. Por lo general, se va a nadar. A medida que disminuye la temperatura, los movimientos se reducirá y el pescado pierda el equilibrio. Un plano quirúrgico de anestesia se alcanza cuando los peces se pueden manejar sin reaccionar. Para mantener a los peces bajo anestesia quirúrgica, los dedos deben estar fríos, por lo que mantenerlos en el agua antes de manipular el pescado. La esponja también deben mantenerse en frío a la misma temperatura que el agua utilizada para anestesiar a los peces. Es importante para saturar la esponja con agua que se sufficiently fría para mantener la anestesia una vez que el pescado se coloca en la misma.
Inyección: Antes de las inyecciones de empresa, es posible que desee analizar por lo menos un pescado para tener una idea del espesor de pared del cuerpo. Esto puede ayudarle a juzgar hasta qué punto la aguja tiene que insertar a entrar en la cavidad abdominal. Además, al insertar la aguja, se puede sentir la pared del cuerpo "dar" cuando la aguja entra en la cavidad abdominal. Durante la inyección, tomar medidas para mantener al paciente feliz. Asegúrese de que la esponja se satura con la temperatura del agua fría correcta para evitar que el pescado de reactivación durante la inyección. Una esponja muy suave y saturado es importante para minimizar los daños a las escalas y el moco que cubre de la piel. Una esponja bien saturada es también importante para mantener las branquias aireado. Le recomendamos la esponja de espuma se enumeran a continuación en Materiales. Finalmente, una vez que el pescado esté anestesiado, trabajar con rapidez para minimizar el tiempo que el pescado es bajo.
Recuperación: El pescado debe recuperarse de la anestesia prácticamente al entrar en el tanque de agua caliente. Si el pescado no comienzan a nadar inmediatamente, agitar suavemente el agua hacia sus branquias para acelerar la recuperación. Si la recuperación es lenta, entonces los peces se hundió muy rápido y se debe ajustar el procedimiento de anestesia adecuada. Las posibles causas de la lenta recuperación se discuten en La anestesia.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Juvenile Diabetes Research Foundation conceder 5-2007-97 (a VEP), por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales subvenciones R01DK064973 (a VEP), R01DK48494 (a LHP), T32DK07074 (apoyo SCE), K01DK083552 (a MDK), y por P60DK20595 a la Universidad de Chicago Investigación de la Diabetes y el Centro de Formación. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK oa los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
