Summary
Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.
Abstract
Kimyasal zebrafish tedavi için uygun bir yöntem balık tarafından ele alınacak tank su, reaktif tanıtmak. Ancak, bu yöntem reaktif emilir veya balık başına ne kadar zor biliyor yapar. Metabolik çalışmalar özellikle de ilgili bazı deneysel sorular, ağırlığına göre her bir balık için belirli bir miktar sunarak daha iyi ele alınabilir. Burada yetişkin zebrafish içine intraperitoneal (IP) enjeksiyon için bir yöntem mevcut. Enjeksiyon, karın boşluğuna pelvis posterior. Bu prosedür, büyük balıklar için kullanılan veteriner yöntemler uyarlanmıştır. Biz sıfır mortalite gibi, güvenli. Ayrıca, 127 enjeksiyonlar sadece 5 enjeksiyon yerinde kanama, kanama ve bu vakaların her biri, kısa süreli, kalıcı birkaç saniye idi ve kan kaybı miktarı küçüktü. Bu yordamı ile Başarı, anestezi, enjeksiyon ve kurtarma ağırlığında, oruç da dahil olmak üzere birkaç adım ile balık nazik işleme gerektirir. Önlemler prosedür boyunca stresi en aza indirmek için gereklidir. Önlemler küçük bir enjeksiyon hacmi ve 35G iğne ile içerir. Biz Cortland tuz çözeltisi ozmotik tatlı su balıkları için dengeli bir araç olarak kullanırlar. Solungaçları Havalandırma, enjeksiyon sırasında suya doymuş bir sünger içinde bir çukur balık tutarak, yavaş operculum'un hareketleri sağlayan bir cerrahi anestezi uçak, ilk balık getirerek enjeksiyon işlemi sırasında tutulur ve ikinci sırada yer alıyor. Biz, şekeri enjekte ve kan glikoz düzeyi yükselmeye ve normal bir sonraki geri izleme IP enjeksiyon yararını göstermektedir. Stres, teleost balık kan şekeri artırmak için ve Bilindiği gibi, araç-enjekte ve non-enjekte yetişkinlerde kan şekeri düzeylerini karşılaştırmak ve yordam kan şekeri önemli bir artışa neden olmadığını göstermektedir.
Protocol
1. Pre-enjeksiyon Hazırlıkları
- Enjeksiyon için en az 24 saat önce Hızlı balık. Bu bağırsak ampul (mide) içeriğini boşaltmak olacaktır. Temel açlık protokol temiz bir tank, kendi normal yoğunlukta balık transferi için, daha sonra gıda kesintisi. (Örneğin, kan şekeri çalışmaları için) daha sıkı şartlar gerektirir, uzun süreli açlık, Tartışma ek konuları bakın.
- Cortland tuz solüsyonu (Perry ve ark, 1984) hazırlayın.
Distile su ile 100 mL hacim için aşağıdaki çözülür:
725 mg NaCl (124.1 mM)
38 mg KCl (5.1 mM)
41 mg Na 2 HPO 4 (2.9 mM)
24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM)
16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM)
100 mg NaHCO 3 (11.9 mM)
4 g Polyvinylpyrrolidone (PVP) (% 4)
1.000 USP birimleri Heparin
Filtre, sterilize ve 4 saklamak ° C - Mikroskop hazırlayın.
- Mikroskop tabanı dökülmeleri durumunda koruma için naylon ile örtün.
- Plastik wrap üstüne bir kağıt havlu koyun. Cerrahi tablo kağıt havlu üstüne oturacak.
- Ön ayarlamak cerrahi tablo görüntüleme ve sünger odaklanarak odağı.
- Balık tartılır.
- , Yaklaşık 1 / 3 balık tesisi su ile dolu bir 500 ml beher doldurun.
- Dara dengesi.
- Net kullanarak balık toplayın. Net ve kısa bir süre kağıt havlu üzerinde net dabbing balık uzak aşırı su Wick. Balık behere aktarın.
- Balık tartılır.
- Temiz bir tank için balık aktarın.
- Kendi etiketli tankına her tartılır balık aktarın.
- Balık ağırlığına göre her bir balık için enjeksiyon hacmi hesaplayın.
- Şırınga ve enjeksiyon ekipmanı hazırlayın. Enjeksiyon için, 35G Eğimli çelik iğne ve 10 ul NanoFil mikroenjektör tavsiye ederiz. Üreticinin talimatları izleyerek NanoFil şırınga ve silflex tüp hazırlayın. Şırınga ve tüp herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için önemlidir. Şırınga ve tüp dolum sonra, pompa şırınga monte ve program ilk balık için enjeksiyon hacmi.
- Cerrahi bir tablo hazırlayın.
- Yüksekliği yaklaşık 20 mm, böylece yumuşak bir sünger (# L800-Ge, Jaece Industries gibi) kesin. Düz yüz, 10-15 mm derinliğinde bir kesim olun. Bu kesim, enjeksiyon için balık tutacak çukur.
- 60 mm Petri kabı içine sünger ayarlayın.
- Petri kabı, uygun büyüklükte bir pipet ucu kutusu kapağının içine sünger ile ayarlayın. Kapak sünger sıcaklık korumaya yardımcı olmak için su tutmak için yeterli büyüklükte olması gerekiyor, ancak bu şekilde almak için yeteri kadar sığ olmalıdır. Biz 11,4 cm L x 7,7 cm G x 1,5 cm olan bir P200 uç kutusu kapağı D.
- Anestezik hazırlayın.
- Balık tesisi su ezilmiş buz küpleri kullanarak olun.
- Temiz bir buz kovası ezilmiş buz doldurun.
- Cerrahi tablo 2.4 litre Rubbermaid gıda saklama kabı gibi daha büyük bir kap içine koyun.
- Tesisin su (sıcak) bazı dış kabı ve cerrahi tablo içine dökün. Ayrıca, sıcak tesisi su rezervi Yakın tutun.
- Dış kabı içine bir termometre koyun.
2. Anestezi, Enjeksiyon ve Kurtarma
- Anestezik dış kabı artı mikroskop bitişik cerrahi tablo yerleştirin. Yakındaki kova buz yongaları var.
- Için su sıcaklığı 17 ° C buz yongaları ekleyerek getir. Önemli: Bu adım için 17 ° C altına gitmeyin.
- Net dış kabı balık aktarmak için kullanın.
- Yavaş yavaş, 12 ila sıcaklığı düşürmek için ° C, birkaç dakika boyunca. Konteyner buz yongaları eklemek
- Monitör balık davranış: 17 ° C veya biraz daha düşük, balık, genellikle yatay pektoral yüzgeçler yaymak gasp ve hızlı operculum'un hareketleri var. Sıcaklığı düşer gibi, balık yüzme molası daha yavaş ve nihayet yüzebilir. Anestezi, cerrahi düzlemine yaklaştı olduğu gibi, nefes nefese duracak ve operculum'un hareketleri yavaş olacaktır. Ele alınması tepki vermezse ne zaman balık enjeksiyon için hazır. En çok balık, 12 ° C yeterlidir. Büyük balık, soğuk wa gerekebilirter.
- Gerekli sıcaklık doyurmak için sünger (~ 12 ° C veya soğuk), basın ulaşılır.
- Parmaklarınızı balık sıcak ve taşıma sırasında anestezi çıkarmak olacağını yeterince soğuk su tutun.
- Soğuk parmakları ile hafifçe çukur sünger balık transferi. Çukur, karın ve solungaçları ile balık yerleştirin.
- Mikroskop aşamasına cerrahi tablo hızla aktarın.
- Hızlı çalışma, dikkatle pelvik yüzgeçler arasındaki orta hat içine iğne takın. İğne cranially işaret etmelidir ve anüs daha yakın pelvis eklenebilir. Iğne vücut duvarına derin hissetmek gerekir. Uygun hacim enjekte edilir ve iğneyi çıkartın.
- Enjeksiyondan sonra, hemen geri balık transferi sıcak su (~ 28.5 ° C), tank su üzerine sünger balık serbest kurtarma için tankı.
İpucu: balık yüzme hemen başlamazsa, solungaçları doğru yavaşça su dönen kurtarmak için yardımcı olur. - Iğne kontrol edin. Bazen bir ölçekte bağlı olabilir ve bir sonraki enjeksiyon önce çıkarılmalıdır.
- Sonraki enjeksiyon için geri anestezi odasına su sıcaklığı 17 ° C sonraki balık tanıtmadan önce getirmek için, sıcak tesisi su kullanmayın.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1, 0.5 mg / g glikoz veya araç intraperitoneal aşağıdaki Temsilcisi sonuçları . Balık enjeksiyon için 72 saat önceden içirildi. X-ekseni zamanı, enjeksiyon sonrası gösterir. Ortalama ± SEM.
Discussion
Intraperitoneal beş adımları içerir:, açlık, tartma,, enjeksiyon ve kurtarma anestezi. Her adım için en iyi uygulamaların başarıya ulaşmasını sağlamak olabilir vardır. Başarı, sağlıklı bir balık hasta yanı sıra iyi bir deneysel sonuç içerir.
Oruç: 24-saatlik hızlı bağırsak ampul boşaltmak gerekir. Bu uygulama balık veteriner edebiyatı (örneğin, Brown 1993) alınmıştır. Ek açlık hususlar aşağıda tartışılmıştır.
Uzun vadeli oruç: Biz bir 72 saatlik hızlı enjeksiyondan önce temel düzeyde kan şekeri azaltmak için gerekli olduğunu bulduk (Eames ve ark, 2010). Ayrıca glikoz çalışmalar için balık düzgün oruç tuttuklarını olduğundan emin olmak için gerekli olan çok sayıda prosedür olduğunu bulduk. (Alt kısmında hiçbir enkaz) temiz bir tank ile başlayın. Tanklar açıkça 'açlık' olarak etiketlenmiş, çevrimdışı olmalıdır ve bir yerde coşkulu balık bakım personeli onları beslemek olmaz. Tankın dış çevre değerlendirin ve stres, kan şekeri (Chavin ve Young, 1970; Groff ve ark, 1999) yükseltmek için bilindiği gibi bozuklukları vurguladı olan balık önlemek için adımlar atması . Örneğin, bir radyo, her gün balık tankları tutuyordu bankta ameliyat edildi açlık deney vardı. Biz kan şekeri alışılmadık derecede yüksek olduğu ve balık titreşimler tarafından vurgulandı olduğu sonucuna varıldı bulundu. Başka bir stres aşırı kalabalık. Balık, iyi balık yetiştiriciliği uygulamaları ile uyumlu bir yoğunluk tutulmalıdır. Öneriler için, bkz. Brand ve ark . (2002) ve Westerfield (1995). Biz, 9 litrelik tank (3 kat mermerler bu hacim kaplıyor ile) 10-12 balık bir yoğunlukta balık açlık iyi sonuçlar oldu. Cinsiyetlerin ayrılması strese neden olabilir, bu yüzden hızlı sırasında seks karışık bir nüfusu korumak öneririz. Bu yumurta döşenebilir anlamına gelir ve yumurta yedikleri olmayacak böylece sekestre gerekir. Yumurta ayırmak için basit bir yolu, 2-3 kat mermer ile tank alt kapağı. Su kalitesi, yumurta ve atık kaldırma ve günlük yaklaşık% 10-15, tank suyu değiştirerek bakıma ihtiyacı vardır. Sifon, yumurta ve atık çıkarmak için iyi çalışır.
Tartım: anestezi değil balık tartım, hassas tartım sağlamak için, beher içine net su transferi en aza indirmek için alınması olmalıdır. Net (balık), kağıt havlu, lekelenen ise, aşırı su çoğunluğu kaldırılmış olabilir ve ağırlığını doğru olarak ölçülebilir. Önce ağırlığında balık uyutmak için daha kolay olabilir, ama biz bir gün içinde iki kez balık anestezi olası etkileri test etmedim. Biz anestezi yapıldıktan sonra yeniden ağırlığında balık daha sonra file / blot yöntemi ile ilk balık ağırlığında bizim teknik test ve hafifçe kuru lekelenen. Ağırlık yöntemleri arasında anlamlı bir fark bulundu (P = 0,7927, t-testi). Ayrıca, biz bu file / (yok blot) düşülmektedir gibi sadece en kısa sürede beher balık transferi ile karşılaştırıldığında, blot yöntemi etkilenen kan şekeri olmadığını test etti. Biz iki transfer yöntemleri arasında kan glikoz düzeyi açısından anlamlı bir fark bulundu (P = 0,2241, t-testi).
Anestezi: Kimyasal anestezi birçok çalışmalar için uygun olabilir. Burada birçok anesteziklerin (tricaine/MS-222 (Brown, 1993) dahil), kan şekeri yükseltmek için, alternatif olarak soğuk su anestezi göstermiştir. Daha önceki çalışmalarda, soğuk su kan şekeri (Eames ve ark, 2010) zebrafish yükseltmek değil yaptığı tespit ettik.
Soğuk su anestezi için, sıcaklık yavaş yavaş azaltılmalıdır. Düşüş oranı, küçük balık büyük balık daha hızlı altında gidiyor, balığın büyüklüğüne bağlı görünüyor. Enjeksiyonu takiben, balık (aşağıya bakın) anestezi çok yavaş iyileşmekte olduğunu gözlemleyebiliriz. Başlangıç sıcaklığı sıcaklığı çok hızlı bir şekilde azalmıştır çok düşük, ya da zaman zaman da yol açabilir. Başlangıç sıcaklığı suya girdikten sonra eğer yanal balık virajlarda çok düşük. Başlangıç sıcaklığı doğruysa, balık başlangıçta dengesini koruyacaktır. Pektoral yüzgeçler, yatay konumda döndürmek gasp ve hızlı operculum'un hareketleri var. Genellikle, yüzmek. Sıcaklık düştükçe, hareketleri azalacak ve balık denge kaybedersiniz. Balık tepki olmadan işlenebilir bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşılır. Cerrahi anestezi altında balık korumak için, parmaklarınızı, soğuk olabilir, bu yüzden balık işleme önce su tutmak gerekir. Sünger balık anestezi için kullanılan suyun aynı sıcaklıkta soğuk muhafaza edilmelidir. Sufficie su ile sünger doyurmak için önemlidir.balık üzerine konulduğunda anesteziyi idame ettirmek için ntly soğuk.
Enjeksiyon: üstlenen enjeksiyonları öncesinde, vücut duvar kalınlığı bir anlamda almak için en az bir balık incelemek isteyebilirsiniz. Bu karın boşluğuna girmek için iğne eklemek için ne kadar ihtiyacı yargılamak için yardımcı olabilir. Ayrıca, iğneyi, iğne karın boşluğuna girdiğinde vücut duvarı "vermek" hissedebilirsiniz. Enjeksiyon sırasında, hasta mutlu etmek için adımlar atın. Sünger enjeksiyon sırasında canlandırılması balık önlemek için doğru sıcaklık soğuk su ile doymuş olduğundan emin olun. Iyi doymuş ve yumuşak bir sünger, ölçekler ve cildi kaplayan mukus zarar en aza indirmek için önemlidir. İyi doymuş sünger solungaçları gazlı tutmak için de önemlidir. Biz çok Malzemeleri altında aşağıda listelenmiştir köpük sünger tavsiye ederiz. Son olarak, bir kez balık anestezi, balık altında olduğu zaman en aza indirmek için hızlı çalışır.
Kurtarma: balık hemen hemen sıcak bir tankın su girdikten sonra anestezi kurtarmak gerekir. Balık kurtarma hız solungaçları doğru girdap su yavaşça hemen yüzme başlamazsa. Eğer toparlanmanın yavaş, sonra balık çok çabuk altında gitti ve uygun anestezi prosedürü ayarlamanız gerekir. Anestezi altında yavaş toparlanma olası nedenleri tartışılmıştır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 5-2007-97 (VEP), Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen hibe R01DK064973 (VEP), R01DK48494 (LHP), T32DK07074 (SCE destekleyen), K01DK083552 (MDK) ve Chicago Üniversitesi Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi için P60DK20595 tarafından. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDDK veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Foam Sponge | Jaece Industries | L800-D | |
| 60 mm Petri dish | |||
| Pipet tip box lid | not too deep, e.g. 1.5 cm | ||
| Plastic storage container | deep, e.g. 7 cm | ||
| Thermometer | |||
| Crushed ice | made from facility water | ||
| Warm facility water | 1 liter or more | ||
| 500 ml beaker | for weighing | ||
| NanoFil syringe | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | or Hamilton syringe |
| 35 gauge needle | World Precision Instruments, Inc. | NF35BV-2 | beveled |
| Silflex tubing | World Precision Instruments, Inc. | SILFLEX-2 | |
| UltraMicroPump III and Micro4 controller | World Precision Instruments, Inc. | UMPS-1 | |
| Foot switch | World Precision Instruments, Inc. | 15867 | |
| Dissecting microscope | |||
| Plastic wrap | |||
| Paper towels | |||
| Cortland salt solution |
References
- Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).
- Brown, L. A. Anesthesia and restraint. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).
- Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Chavin, W., Young, J. E. Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L. Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).
- Groff, J. M., Zinkl, J. G. Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).
- Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).
- Reavill, D. R. Common diagnostic and clinical techniques for fish. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).
- Stoskopf, M. K. Surgery. Fish Medicine. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).
