Summary
Ce manuscrit démontre et explique les techniques utilisées pour étudier la susceptibilité de pesticides et de détecter la résistance au contact et des pesticides systémiques dans les arthropodes nuisibles.
Abstract
Résistance aux pesticides est un problème croissant, car les pesticides sont une partie intégrante de l'agriculture de production à haut rendement. Lorsque peu de produits sont étiquetés pour un ravageur individu au sein d'un système de culture en particulier, des options de lutte chimique sont limités. Par conséquent, le même produit (s) sont utilisés de façon répétée et continuelle pression de sélection est placée sur le ravageur cible. Il ya les coûts financiers et environnementaux associés au développement de populations résistantes. Le coût de la résistance aux pesticides a été estimée à environ 1,5 milliard $ chaque année aux États-Unis. Ce document décrit les protocoles, actuellement utilisé pour surveiller des arthropodes (insectes spécifiquement) des populations pour le développement de la résistance. Le test de flacon pour adultes est utilisée pour mesurer la toxicité pour les insecticides de contact et une modification de ce test est utilisé pour des plantes insecticides systémiques. Dans ces essais biologiques, d'insectes sont exposés à l'insecticide de qualité technique et les réponses (mortalité) a enregistré à un moment précis d'intervalle post-exposition. Les données de mortalité sont soumis à l'analyse probit Connexion dose de générer des estimations d'une concentration létale qui fournit la mortalité à 50% (CL 50) des populations cibles et une série de limites de confiance (CL) que les estimations de la variabilité des données. Lorsque ces données sont collectées pour une gamme d'insecticide-populations sensibles, la CL 50 peut être utilisé comme données de base à des fins de surveillance future. Après les populations ont été exposés à des produits, les résultats peuvent être comparés à une CL 50 précédemment déterminé en utilisant la même méthodologie.
Protocol
1. Présentation
La production alimentaire est devenue la plus grande importance à la réalisation d'ici 2025 le monde va atteindre une population de 8,04 milliard de personnes 1. Il y aura la nécessité de fournir une plus grande quantité de cultures vivrières que ce n'est actuellement produite. Disponibilité de la nourriture adéquate ne sera pas capable sans l'utilisation de produits phytopharmaceutiques tels que les pesticides pour augmenter la quantité de récoltes et de maintenir la qualité. Basé sur la dépendance historique et actuelle sur les pesticides, les instances de la résistance aux pesticides continueront de se produire et être rapportés dans la littérature scientifique.
Résistance aux pesticides est problématique car les produits sont une composante intégrante de l'agriculture de qualité de production à haut rendement et haute. Cependant, la surutilisation et / ou la mauvaise utilisation d'un pesticide peut conduire au développement de la résistance qui peut être préjudiciable à la production agricole. Ravageurs (ie, les insectes, les mauvaises herbes, agents pathogènes, etc) développent une résistance par une variété de mécanismes, mais un facteur déterminant majeur pour le développement de la résistance est le manque de pesticides homologués 1 avec des modes d'action indépendants disponibles pour utilisation. Lorsque peu de produits sont étiquetés pour un ravageur individu au sein d'un système de culture en particulier, des options de lutte chimique sont limités. Par conséquent, le même produit chimique (s) est utilisé à plusieurs reprises et la pression de sélection continue est placée sur le ravageur. Ce problème est aggravé lorsque le ravageur a plusieurs générations en une seule année et chaque génération est exposée au pesticide.
Il ya les coûts financiers et enrivornmental associée à la résistance 2. La résistance des parasites conduit à des taux plus élevés et des applications plus fréquentes de pesticide nécessaire pour obtenir un contrôle satisfaisant. Les pertes de rendement sont susceptibles de se produire même après l'utilisation croissante de pesticides en raison de l'échec à contrôler le ravageur cible. Pimentel deux estimations de ces coûts de la résistance aux pesticides aux Etats-Unis à environ $ 1,5 milliard par an.
Les enquêtes de la sensibilité aux pesticides chez les populations de ravageurs est une approche proactive afin de détecter tout changement dans les performances d'insecticides et de fournir un avertissement précoce de modifier les stratégies de lutte chimique. En modifiant les stratégies de lutte intégrée dans l'ensemble, la viabilité d'un pesticide donné peut être prolongée, qui à son tour, est important pour l'agriculture de continuer à fournir suffisamment de nourriture et de fibres pour le monde. Ce document décrit un protocole qui peut être utilisé pour surveiller la sensibilité aux insecticides et de détecter le développement de populations résistantes aux insecticides en utilisant le test flacon adulte 3 pour les insecticides de contact et une modification de ce test pour les insecticides systémiques végétales 4.
2. Méthodes
2.1 Déclaration de sécurité
En utilisant les précautions de sécurité approprié est important lorsqu'il s'agit d'insecticides. Consultez la Fiche de Données de Sécurité (FDS) pour les équipements de protection individuelle (EPI) avant la manipulation des pesticides. Formation en laboratoire spécifique sur la manipulation des pesticides dans les laboratoires devraient être tenus par le personnel avant de tenter toute bioessais.
2.2 Solution mère Rendre
Développer une solution stock d'une concentration connue d'une source de l'ingrédient actif des insecticides (IA). Toutes les concentrations souhaitées inclus dans l'essai biologique des traitements seront effectués à partir de la solution stock d'origine. Pour l'intérêt de ce papier, 100ml de 100 pg / ml, solution sera développé comme une solution de réserve, toutefois, une concentration peut être dilué de cette concentration initiale. Ajustez la quantité de l'IA de qualité technique à peser sur la base des pour cent de pureté.
Montant à peser = (volume à faire) X ([# g / ml, solution] / [purity/100%])
Par exemple, il faudrait 10152.284 mg d'AI techniques pour faire 100 ml d'une 100 pg / ml, solution d'un insecticide de qualité technique d'une pureté de 98,5%:
(100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10,152,284 mg
2.2.1 Test de Vial adultes pour les insecticides de contact
Remplir partiellement une fiole jaugée avec de l'acétone et de peser le montant ajusté de l'IA d'insecticide. Rincer le bateau de poids avec de l'acétone dans le ballon pour supprimer tous les insecticides du bateau peser. Remplissez la fiole jaugée à la ligne de l'obtention du diplôme avec de l'acétone. La plupart des solutions détenus dans des conditions réfrigérées sera de maintenir une activité sans perte appréciable d'efficacité pendant environ un mois.
2.2.2 Modification du test Vial adultes pour des insecticides systémiques
Intoxication des insectes aux insecticides systémiques est nettement différente de celle des produits de contact. Les produits systémiques doivent généralement être ingérés par l'insecte à devenir actifs au lieu de l'insecte having exposition directe au produit avec des insecticides de contact. Par conséquent, le test de flacon pour adultes a été modifié afin d'insecticides systémiques à tester. Le poids de l'IA nécessaire pour la solution stock est calculé similaire à celle mentionnée dans la section 2.2. La méthodologie est similaire, sauf l'AI est dissous dans un 10% par le miel de poids: une solution d'eau. Cette solution doit être faite dans les 24 heures d'initiation de l'essai biologique. Si le matériau de qualité technique n'est pas soluble dans l'eau, une forte concentration de la solution insecticide peut être faite avec de l'acétone telle que seul un petit volume de l'insecticide: le mélange d'acétone est ajoutée à du miel: une solution d'eau 4.
2.3 Concentrations Déterminer une gamme de concentrations et de développement
Déterminer les concentrations appropriées nécessaires pour établir l'éventail des réponses pour les essais biologiques peuvent être difficiles. Plusieurs répliques peuvent être nécessaires pour définir la gamme de concentrations et cela se fait par essais et erreurs. En outre, la plage peut changer avec le temps si la population des changements des niveaux de sensibilité. De nombreux autres facteurs doivent être considérés dans l'établissement de concentrations finales et comprennent: la famille d'insectes, de la classe d'insecticides, de la taille d'insectes, etc Précédemment publié les résultats des tests flacon adulte peut aider à la sélection initiale des concentrations d'insecticides. Bioessais ont été publiés pour: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, 8-10 et Pentatomidae Miridae 11-14; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, 18-19 et Coccinellidae Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20; Lepidoptera: Tortricidae 21 et Noctuidae 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7, et Aphelinidae 18.
Les concentrations sont basées sur les «X» mg / ml de solution. Toutefois, lorsque les flacons sont préparés pour l'épreuve flacon adultes, seulement 0,5 ml sera ajouté à chaque flacon, par conséquent, la concentration du flacon est à moitié la concentration fait. Une fois que les concentrations sont choisis, l'équation suivante peut aider à déterminer la quantité de solution ajoutée pour rendre la concentration voulue.
(C1) (V1) = (C2) (V2)
Où C1 est la concentration de la solution mère; V1 est le volume de stock nécessaire pour rendre la nouvelle concentration; C2 est la concentration en cours de préparation, et V2 est le volume de la nouvelle concentration. Par exemple, 5 ml de solution stock de 100μg/ml est nécessaire de faire un 100ml d'une 5μg/ml. Cette solution aboutirait à 5μg/ml flacons enduits à une concentration de 2.5μg/vial.
5mls = [(5μg/ml) (100ml)] / (100μg/ml)
2.3.1 Test de Vial adultes pour les insecticides de contact
Remplir partiellement Flaks volumétrique, et le montant calculé aliquote de la solution mère nécessaire pour rendre la concentration voulue. Remplissez la fiole jaugée avec de l'acétone à la ligne de diplôme et passer à la section 2.4 ou sceller avec du Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) pour le stockage au réfrigérateur pour une utilisation ultérieure. La plupart des solutions sont bonnes pour un mois.
2.3.2 Modification du test Vial adultes pour des insecticides systémiques
Ce processus est le même que précédemment mentionné en 2.3.1, sauf 10% par le miel de poids: une solution d'eau se substitue à l'acétone. Mélangez assez de miel: une solution d'eau de prendre toutes les concentrations souhaitées. Ces solutions doivent être utilisés dans les 24 heures de préparation.
2.4 Préparation des flacons
2.4.1 Test de Vial adultes pour les insecticides de contact
Si les concentrations étaient entreposés dans le réfrigérateur, permettent de réchauffer à température ambiante. Le volume des modifications à base d'acétone sur la température qui peut affecter la concentration d'insecticide. Code couleur 20 flacons en verre ml (équipé pour les capsules à vis) pour les concentrations à l'aide de peinture ou des marqueurs.
Régler une pipette répéter pour offrir 0.5ml/concentration. Initier le travail avec un contrôle d'acétone, suit avec la plus faible concentration et en continuant avec des concentrations croissantes jusqu'à ce que toutes les concentrations ont été utilisées. Verser environ la moitié du volume de solution tant que le nombre réel des flacons à traiter (par exemple, pour 40 flacons 20mls) dans un petit bécher. Lorsque la solution n'est pas utilisé, il couvre pour minimiser l'évaporation qui peut causer des changements dans la concentration. Aspirer la solution insecticide dans la pipette de répéter et de distribuer une solution de 0,5 ml dans des flacons en verre individuel.
Immédiatement après le traitement, les flacons de verre sont placés sur un rouleau de hot-dogs commercial. Comme le tour des rouleaux, des flacons en verre de rotation et l'acétone s'évapore, laissant l'intérieur du flacon revêtu de la techniqueal insecticides de qualité. La chaleur peut dégrader les insecticides, par conséquent, il est important pour la chaleur d'être éteint. Cela peut être fait soit en déconnectant l'élément chauffant sur un modèle qui chauffe et rouleaux simultanément et est contrôlé par le même interrupteur ou en utilisant un modèle de rouleaux de hot-dogs qui a indépendamment fonctionnement des commutateurs pour l'élément chauffant et des rouleaux. Éviter de traiter plus de flacons que le rouleau est titulaire; l'acétone peut s'évaporer avant les flacons de verre sont tournés et ils ne peuvent pas recevoir un revêtement sur les murs, même flacon.
Laisser les flacons de tourner jusqu'à ce que tous acétone s'est évaporée. Il peut-être une fine couche d'acétone-condensation sur les murs flacon, par conséquent, les flacons doivent être examinés individuellement. Temps nécessaire pour rouler les flacons varie en fonction des conditions de laboratoire. Une fois les flacons sont à sec, chapeau et les stocker soit dans des conditions réfrigérées ou sombre. Les insectes ont été observés au repos sur les couvercles avec doublures conique ou doublures feuille déchirée qui pendent en dessous de la lèvre du flacon (c'est à dire, en évitant les surfaces traitées) et, par conséquent, il est important d'utiliser des non-alignés couvercles.
Tout reste de solution non utilisée pour préparer les flacons doivent être éliminés correctement. La solution restante dans la fiole jaugée peuvent être scellés avec du parafilm et les conserver au réfrigérateur. Date de flacons quand ils sont préparés, parce que différents insecticides ont des durées de conservation différentes. Par exemple, pyréthrinoïdes enduit de flacons sont bons pour environ un mois, tandis que les flacons revêtus d'un insecticide plus instable, comme un composé organophosphoré, ont une durée de deux semaines ou moins.
2.4.2 Test de modification Vial adultes pour des insecticides systémiques
Mousse florale est nécessaire pour servir de substrat pour fournir la solution d'insecticide pour les insectes 4. Coupez la mousse florale (X 12mm 12mm) morceaux en utilisant un perce-bouchon. Placer un morceau de mousse florale dans les flacons de verre décrit précédemment. Remplissez la pipette répétant ajusté pour offrir une solution de 0,5 ml et distribuer sur la mousse florale. Ce volume de liquide devrait saturer le morceau de mousse florale, mais ne devrait pas dépasser le niveau de la mousse dans le flacon. Encore une fois le travail en séquence de la commande (10% par le miel de poids: une solution d'eau seulement) et les plus bas au plus fortes concentrations.
2.5. Flacons Stockage
2.5.1 Test de Vial adultes pour les insecticides de contact
Lors du stockage des flacons d'insecticide couché, connaître les propriétés de l'insecticide. Différents insecticides ont des besoins de stockage différents, tels que: les pyréthrinoïdes sont sensibles à la lumière et peut être conservé à température ambiante, mais dans l'obscurité, mais insecticides organophosphorés sont sensibles à la température et doivent être stockés dans un congélateur. Si des insecticides sont nécessaires pour être stockés dans le congélateur, ils doivent être réchauffé à température ambiante avant d'exposer les insectes.2.6 Test biologique
Recueillir les insectes d'être testé. Ce processus peut être fait en utilisant des pièges à phéromone, les filets de balayage, ou tout autre moyen de capture de masse. Les insectes devraient être tenues pour 8-24h pour permettre la mortalité naturelle à produire pour les personnes blessées pendant le processus de collecte; leur fournir la nourriture et une source d'humidité durant cette période. Test de 10 à 25 insectes par concentration (10 minimum); plus le nombre d'insectes testés, les plus robustes de l'ensemble de données sera. Lors de la sélection des insectes pour le bio-essai, choisissez les sujets sains, actifs et jetez les individus léthargique ou anormales. Placez des insectes dans les flacons de telle sorte qu'ils sont exposés à toute la gamme des concentrations et pas seulement une concentration à la fois. Cette procédure permettra d'éviter de placer les personnes les plus saines et actives dans un ou quelques concentrations. De plus, si ce n'est pas possible de mener l'expérience avec un minimum de 10 insectes par concentration, d'exposer autant que possible à chaque concentration. Puis recueillir plus d'insectes de la région de même échantillon dans un court laps de temps (deux à trois semaines) et répétez l'expérience. Certains insectes peuvent perdre la sensibilité (renforcer la résistance) que le cours de la saison des cultures, par conséquent, la réponse des individus recueillis au début du printemps peuvent être différentes de celles recueillies à l'automne 28.
Élaborer des critères pour évaluer la mortalité. Les critères les plus couramment utilisés pour classer les insectes moribonds ou morts sont un manque de coordination des mouvements. Ces observations peuvent inclure l'incapacité de droit lui-même s'il est placé sur sa surface dorsale, incapable de maintenir en vol coordonné de 1m ou le manque de coordination des mouvements lors délicatement poussé avec un instrument contondant. Si l'individu ne peut se redresser, mais tombe sur, il n'ya pas de mouvement coordonné; l'insecte doit être considéré comme mort. L'insecte peut éprouver des difficultés se redresser sur une surface lisse, par conséquent, il peut être nécessaire de fournir de l'insecte une surface de sorte qu'il est capable de gagner la traction nécessaire pour se redresser. Enregistrementle nombre de survivants et des personnes mortes pour calculer le taux de survie pour chaque concentration.
2.6.1 Test de Vial adultes pour les insecticides de contact
Placer l'insecte (s) dans le flacon et le bouchon sécurisé lâchement. Le couvercle a besoin pour empêcher l'insecte de s'échapper, mais être suffisamment lâche pour permettre l'écoulement de l'air. Pour la plupart des épreuves biologiques d'insectes, un seul insecte est placé dans chaque flacon, cependant, de petits insectes, mouches blanches par exemple, ou de thrips, peuvent être exposés à un taux de moins de 30 individus par flacon 6, 15. Placer les flacons en position verticale à température ambiante jusqu'à ce que les insectes sont évalués pour la mortalité à l'extrémité de l'essai biologique. Les temps d'exposition peuvent différer des espèces et, éventuellement, l'insecticide 3,5-27. Dans le processus d'établissement des niveaux de toxicité initiale avec un nouvel insecte ou chimiques, de surveiller les sujets à de multiples points heure prévue après l'exposition. Les examens peuvent être résilié lorsque la mortalité à la concentration maximale est de 100% tout en conservant la survie élevé (mortalité <10%) dans le contrôle non traitées à l'insecticide. Si la mortalité de 100% n'est pas atteint à la plus forte concentration en survie élevé dans le contrôle, l'essai biologique devrait être répété en utilisant une gamme de concentrations plus élevées. Idéalement, les taux de mortalité devrait augmenter avec l'augmentation de la concentration en insecticide.
Certains insectes, lorsqu'ils sont exposés pendant 24 heures, nécessite une source d'humidité (par exemple, un petit morceau de matière végétale) 12. Lorsque vous travaillez avec un insecte délicat, il est avantageux de déterminer combien de temps l'insecte peut survivre dans le flacon, sans une source d'humidité avant l'exposition aux insecticides dans le test flacon adulte. Cette information peut être déterminé en plaçant l'insecte dans un flacon avec et sans une source d'humidité et le suivi de sa survie au cours du temps avant de mener les enquêtes insecticides réelle.
2.6.2 Test de modification Vial adultes pour des insecticides systémiques
Avant le début de l'essai biologique, de déterminer si l'insecte peut se nourrir et survivre sur la mousse florale saturé avec du miel: une solution d'eau en l'absence d'insecticide. Placez des insectes dans des flacons avec la mousse florale saturé avec du miel: l'eau uniquement (ou de miel: l'eau avec le plus grand volume d'acétone utilisé dans la préparation de la concentration de l'eau avec des non-insecticide de qualité technique solubles) et de surveiller la survie de plusieurs jours. Cette modification de l'épreuve flacon adulte a été seulement examinée avec un Miridae 4 et un Pentatomidae 29, par conséquent, la détermination de la durée de l'épreuve nécessite une plus grande expérimentation que pour l'essai biologique des insecticides de contact. Par exemple, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) a été évaluée pour la mortalité à 24 heures après l'exposition au thiaméthoxame, mais 72 heures pour l'imidaclopride 4. Mortalité des Oebalus pugax F. a été évaluée à 96 heures lorsqu'elle est exposée à dinotéfurane 29. Par conséquent, la survie des insectes dans des flacons de contrôle doit être constamment élevée pendant plusieurs jours avant une note de mortalité précise de l'intoxication aux insecticides peuvent être faites.
Placer l'insecte (s) dans le flacon à scintillation avec la mousse florale saturées. Au lieu d'étanchéité des flacons avec couvercles, joint flacons avec une boule de coton. Placer les flacons en position verticale à température ambiante jusqu'à ce que les insectes sont évalués pour la mortalité. Comme mentionné précédemment le taux de mortalité, à intervalles réguliers. Examen peut être résilié en cas de mortalité de 100% à la concentration maximale en survie élevé (mortalité <10%) dans le contrôle. Il peut être nécessaire de tester la concentration supplémentaire.
2.6.3 Analyse des données
Correct pour le taux de mortalité dans le traitement de contrôle à l'aide d'une formule selon Abbott 30.
La mortalité corrigée (%) = ((contrôle de la survie% -% de survie traitée) / contrôle de survie%) x 100
Analyser les données en utilisant la méthode des probits dose logarithmique pour déterminer la concentration létale nécessaire pour tuer 50% d'une population (CL 50) et d'établir des intervalles de confiance à 95% (CL). Plusieurs logiciels sont disponibles pour déterminer la valeur CL 50 (SAS: PROC PROBIT 31, Polo-Plus 32).
3. Remarques
- Travailler avec de l'acétone et les insecticides sous une hotte d'air négative-débit.
- Lors du remplissage des fioles jaugées, il est préférable d'avoir deux bouteilles de lavage de l'acétone. Une bouteille de lavage qui a été adapté pour une livraison rapide des liquides et un pour la livraison lente. Retirez une partie du bras afin de pouvoir créer une plus grande ouverture et cette bouteille peut être utilisée pour la livraison d'un volume important rapidement. Une fois que l'acétone se rapproche de la ligne de graduation, les bouteilles changement et utiliser la bouteille de lavage avec la livraison plus lent de sorte que vous avez plus de contrôle sur le montant qui est dispensé. Si une bouteille est remplie au-dessus de la ligne de graduation, laissez le dessus de l'acétone et laissez évaporer à la ligne de graduation. </ Li>
- Notez la quantité nécessaire de la solution stock, nécessaires à la préparation d'une concentration, c'est à dire, si vous remplissez le flacon ¾ du chemin, mais besoin d'ajouter 30ml, vous pouvez aller sur la ligne des diplômes.
Discussion
La valeur CL 50 peut être utilisé pour établir que la susceptibilité de base d'une population cible (s). La valeur de ces données peuvent être dans les enquêtes de surveillance futurs, ou pour le but immédiat de comparer les résultats actuels à celle d'une CL 50 précédemment déterminé pour déterminer la sensibilité de la population cible a changé. Réels CL 50 valeurs peuvent être comparées entre les populations en examinant les intervalles de confiance à 95%, si les limites supérieures et inférieures ne se chevauchent pas, alors il est probable que la population a connu un changement important dans la susceptibilité et dans certaines situations est une indication de la résistance 33. La CL 50 peut également être utilisé pour examiner les changements saisonniers dans l'insecticide esusceptibilitye 28, ou comparer les réponses entre les espèces ou les insecticides AI s. Un travail considérable a également utiliser ces données pour comparer les réponses entre les hommes et les femmes âgées de 10 ou entre adultes et immatures, 10,34. Parfois, les intervalles de confiance sont larges ou pas pu être calculés. Pour gagner des intervalles de confiance plus serré effectuer l'essai biologique avec plus d'insectes et / ou plusieurs concentrations.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Cotton Incorporated Programme de soutien Etat # 08-317MO, USDA / CSREES SR-IPM Grant 2009-34103-20018 et Landis international pour la recherche de financement se rapportant à cette publication.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-100 ml glass beaker | |||
| Volumetric flask with stoppers (can use the amber colored flasks for light sensitive pesticides such as pyrethroids) | |||
| 20ml glass scintillation vials with un-lined lids | |||
| A method for color coating vials (paint or markers) | |||
| Acetone | |||
| Commercial hotdog roller (heat element disconnected) | |||
| 2 wash bottles (one modified such that the opening is large for fast delivery of the liquid and one so that the spout opening is small for slow delivery of the liquids) | |||
| Small weigh boat (make sure all plastic materials acetone safe) | |||
| Access to a balance with 0.001g readability or a higher precision. | |||
| Parafilm M | |||
| Repeater pipettor | |||
| Appropriate tips | |||
| Glass pipettes that fit in the volumetric flask. | |||
| Hood (used to remove the acetone smell) | |||
| A place to store insecticide solutions and vials [refrigerator (solutions), dark room or freezer depending on the chemical (vials)] |
References
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