Summary
Este manuscrito demonstra e discute técnicas usadas para pesquisa susceptibilidade de pesticidas e detectar a resistência ao contato e pesticidas sistêmicos em pragas artrópodes.
Abstract
Resistência de pragas a pesticidas é um problema crescente, pois os pesticidas são parte integrante de alto rendimento agrícola de produção. Quando poucos produtos estão marcados para uma praga individuais dentro de um sistema de cultivo particular, opções de controle químico são limitadas. Portanto, o mesmo produto (s) são usadas repetidamente e contínua pressão de seleção é colocada sobre a praga alvo. Há tanto os custos financeiros e ambientais associados ao desenvolvimento de populações resistentes. O custo de resistência a pesticidas tem sido estimado em aproximadamente US $ 1,5 bilhões por ano nos Estados Unidos. Este artigo irá descrever protocolos, atualmente usado para monitorar artrópodes (insetos, especificamente) populações para o desenvolvimento de resistência. O teste frasco adultos é usado para medir a toxicidade entrar em contato com inseticidas e uma modificação deste teste é utilizado para plantas inseticidas sistêmicos. Nesses bioensaios, os insetos são expostos a inseticidas grau técnico e respostas (mortalidade) registrados em um intervalo pós-exposição específica. Os dados de mortalidade são submetidos a análise de log probit Dose para gerar estimativas de uma concentração letal que fornece a mortalidade para 50% (CL 50) das populações-alvo e uma série de limites de confiança (CL) como estimativas da variabilidade dos dados. Quando estes dados são recolhidos para uma série de mosquiteiros suscetíveis populações, a LC 50 pode ser usado como dados de base para fins de acompanhamento futuro. Após as populações tenham sido expostos a produtos, os resultados podem ser comparados a uma LC previamente determinado 50 usando a mesma metodologia.
Protocol
1. Introdução
Produção de alimentos tornou-se da maior importância com a constatação de que até 2025 o mundo atingirá uma população de 8,04 bilhão de pessoas 1. Haverá a necessidade de fornecer uma quantidade maior de alimentos do que é actualmente produzido. Disponibilidade de alimentos adequados, não será capaz, sem a utilização de produtos fitofarmacêuticos, como pesticidas para aumentar a quantidade de rendimento das culturas e manter a qualidade. Com base na dependência histórica e atual sobre pesticidas, os casos de resistência a pesticidas continuarão a ocorrer e ser relatada na literatura científica.
Resistência de pragas a pesticidas é problemático porque os produtos são um componente integral da agricultura de alto rendimento e alta qualidade de produção. No entanto, o uso excessivo e / ou mau uso de um pesticida pode levar ao desenvolvimento de resistência que podem ser prejudiciais à produção agrícola. Pragas (ou seja, insetos, ervas daninhas, patógenos, etc) desenvolvem resistência por uma variedade de mecanismos, mas um fator motriz para o desenvolvimento de resistência é a falta de agrotóxicos registrados 1 com os modos independentes de ação disponíveis para uso. Quando poucos produtos estão marcados para uma praga individuais dentro de um sistema de cultivo particular, opções de controle químico são limitadas. Portanto, a mesma substância química (s) é usado repetidamente e contínua pressão de seleção é colocada sobre a praga. Este problema é agravado quando a praga tem várias gerações em um único ano e cada geração é exposto ao pesticida.
Há dois custos financeiros e enrivornmental associadas à resistência 2. Resistência a pragas leva a taxas mais elevadas e aplicações mais freqüentes de pesticida necessária para alcançar um controle satisfatório. Perdas de rendimento tendem a ocorrer mesmo depois de aumentar o uso de pesticidas por causa da falta de controle da praga alvo. Pimentel duas estimativas destes custos da resistência a pesticidas nos Estados Unidos em aproximadamente US $ 1,5 bilhão anualmente.
Levantamentos de susceptibilidade de agrotóxicos entre populações de pragas é uma abordagem proativa para detectar qualquer mudança no desempenho de inseticidas e fornecer um aviso antecipado para modificar as estratégias de controle químico. Modificando estratégias de IPM geral, a viabilidade de um pesticida dado pode ser prorrogado, o que por sua vez, é importante para a agricultura de continuar a fornecer comida suficiente e fibras para o mundo. Este artigo irá descrever um protocolo que pode ser usado para monitorar a susceptibilidade de inseticidas e detectar o desenvolvimento de inseticida resistentes populações utilizando o teste de frasco 3 para adultos inseticidas de contato e uma modificação deste teste para inseticidas sistêmicos de plantas 4.
2. Métodos
2,1 Declaração de segurança
Usando as precauções de segurança adequada é importante quando se lida com inseticidas. Consultar a Ficha de Segurança (MSDS) para equipamento de proteção individual (EPI) antes de manusear agrotóxicos. Capacitação laboratorial específico sobre o manuseio de pesticidas em laboratórios devem ser obrigados por pessoal antes de tentar qualquer bioensaios.
2,2 Solução stock Fazer
Desenvolver uma solução estoque de uma concentração conhecida de uma fonte de ingrediente ativo inseticida (AI). Todas as concentrações desejadas incluído como tratamentos no bioensaio será feita a partir da solução estoque original. Para o interesse deste trabalho, 100mls de uma solução a 100 mg / ml será desenvolvida como uma solução estoque, no entanto, qualquer concentração pode ser diluído a partir desta concentração inicial. Ajustar a quantidade de AI grau técnico a ser avaliado com base na pureza por cento.
Montante a ser pesado = (volume de fazer) X ([g # / ml] / [purity/100%])
Por exemplo, seria necessário 10152.284 mg de AI técnica para fazer 100 mls de uma solução a 100 mg / ml de um inseticida grau técnico de pureza de 98,5%:
(100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10.152,284 mg
2.2.1 Teste Vial Adultos para inseticidas de contato
Parcialmente encher um balão volumétrico com acetona e pesam a quantia ajustada de AI inseticida. Lavar o barco de peso com acetona para o balão para remover todos os inseticidas do barco pesar. Encha o balão até a linha de graduação com acetona. A maioria das soluções realizada em condições de refrigeração irá manter a atividade, sem perda significativa de eficácia para cerca de um mês.
2.2.2 Modificação do Teste Vial Adultos para insecticidas sistémicos
Intoxicação dos insetos com inseticidas sistêmicos é distintamente diferente da de produtos de contato. Produtos sistêmicos geralmente devem ser ingeridos pelo inseto para tornar-se ativo em vez do inseto having exposição direta ao produto, com inseticidas de contato. Portanto, o teste frasco adulto foi modificado a fim de inseticidas sistêmicos para ser testado. O peso do AI necessário para a solução estoque é calculado semelhante ao mencionado na seção 2.2. A metodologia é similar, exceto o AI é dissolvido em 10% por peso de mel: solução de água. Esta solução deve ser feita dentro de 24 horas após o início do bioensaio. Se o material de qualidade técnica não é solúvel em água, uma elevada concentração de solução de inseticida pode ser feita com acetona de tal forma que apenas um pequeno volume do inseticida: mistura de acetona é adicionado ao mel: solução de água 4.
As concentrações 2,3 Determinar uma gama de concentrações e em Desenvolvimento
Determinar as concentrações adequadas necessárias para estabelecer o leque de respostas para o bioensaio pode ser difícil. Repetições várias podem ser necessários para definir o intervalo de concentrações e isso é feito por tentativa e erro. Além disso, o intervalo pode mudar ao longo do tempo se a população muda os níveis de susceptibilidade. Inúmeros outros fatores devem ser considerados no estabelecimento de concentrações finais e incluem: família de insetos, classe de inseticida, o tamanho dos insetos, etc Anteriormente publicou os resultados de testes frasco adulto pode ajudar com a seleção inicial das concentrações de inseticida. Os bioensaios foram publicados para: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 e 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, 18-19 e Coccinellidae Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20; Lepidoptera: Noctuidae Tortricidae 21 e 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, Encyrtidae 7, e Aphelinidae 18.
Concentrações são feitas com base em "X" mcg / ml de solução. No entanto, quando os frascos estão preparados para o teste de frasco para adultos, apenas 0,5 ml será adicionado a cada frasco, portanto, a concentração do frasco é metade da concentração feita. Uma vez que as concentrações são escolhidos, a seguinte equação pode ajudar a determinar a quantidade de solução adicionada para fazer a concentração desejada.
(C1) (V1) = (C2) (V2)
Onde C1 é a concentração da solução estoque; V1 é o volume de estoque necessário para fazer a nova concentração; C2 é a concentração a ser preparada, e V2 é o volume da nova concentração. Por exemplo, 5mls de uma solução estoque 100μg/ml é necessário para fazer uma 100mls de um 5μg/ml. Esta solução 5μg/ml resultaria em frascos revestidos em uma concentração de 2.5μg/vial.
5mls = [(5μg/ml) (100mls)] / (100μg/ml)
2.3.1 Teste Vial Adultos para inseticidas de contato
Parcialmente preencher flaks volumétrica, e alíquota do montante calculado de solução estoque necessário para fazer a concentração desejada. Encha o balão volumétrico com acetona para a linha de graduação e vá para a seção 2.4 ou selo com Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) para o armazenamento na geladeira para uso posterior. A maioria das soluções são boas para um mês.
2.3.2 Modificação do Teste Vial Adultos para insecticidas sistémicos
Este processo é o mesmo que anteriormente mencionados em 2.3.1, exceto a 10% por peso de mel: solução de água é substituída por acetona. Misture o mel suficiente: solução de água para fazer todas as concentrações desejadas. Estas soluções devem ser usadas dentro de 24 horas de preparação.
2.4 A elaboração de frascos
2.4.1 Teste Vial Adultos para inseticidas de contato
Se as concentrações foram armazenados na geladeira, deixe atingir a temperatura ambiente. O volume de acetona mudanças com base na temperatura que pode afetar a concentração de inseticida. Código de cores 20 ml frascos de vidro (equipado para as tampas de rosca) para concentrações usando a pintura ou marcadores.
Ajustar um pipetador repetindo para entregar 0.5ml/concentration. Iniciar o trabalho com controle de acetona, seguindo com a concentração mais baixa e continuando com concentrações crescentes até que todas as concentrações têm sido utilizados. Despeje cerca de metade do volume da solução, como o número real de frascos a ser tratada (ou seja, 20mls por 40 frascos) num copo pequeno. Quando a solução não está em uso, cobri-lo para minimizar a evaporação que pode causar mudanças na concentração. Desenhe a solução do inseticida para o pipetador de repetição e dispensar solução 0,5 ml em frascos de vidro individuais.
Imediatamente após o tratamento, os frascos de vidro são colocadas em um rolo de cão comerciais quente. Como a vez rolos, frascos de vidro gira eo evapora acetona, deixando o interior do frasco revestido com a técnicaal inseticida grau. Calor pode prejudicar o inseticida e, portanto, é importante para o calor a ser desligado. Isto pode ser feito tanto por desligar o elemento de aquecimento em um modelo que aquece e rola ao mesmo tempo e é controlado pelo mesmo switch ou usando um modelo de rolo de cachorro-quente que tem funcionamento independente interruptores para o elemento de aquecimento e rolos. Evitar tratar frascos mais do que o rolo de porões; a acetona pode evaporar antes da frascos de vidro são rodados e não pode receber um revestimento uniforme nas paredes do frasco.
Permitir que os frascos para girar até que todos os acetona evaporou-se. Há talvez uma fina camada de acetona-condensação nas paredes frasco, portanto, os frascos precisam ser examinados individualmente. Tempo necessário para rolar frascos varia com base em condições de laboratório. Uma vez que os frascos são cap, seco e armazená-los em condições refrigeradas ou escuro. Insetos têm sido observadas descansando em tampas com forros cônico ou forros folha rasgada que penduram abaixo da borda do frasco (ou seja, evitando superfícies tratadas) e, portanto, é importante o uso de não-alinhados tampas.
Qualquer solução não utilizada para preparar os frascos devem ser eliminados de forma adequada. O restante da solução no balão volumétrico pode ser selada com parafilme e armazenados na geladeira. Data os frascos quando eles estão preparados, porque têm vidas diferentes inseticidas prateleira diferente. Por exemplo, piretróide revestido frascos são bons para cerca de um mês e que os frascos revestidos com um inseticida mais instável, como um organofosforado, têm uma vida útil de duas semanas ou menos.
2.4.2 Teste Vial Modificado Adultos para insecticidas sistémicos
Espuma floral é necessária para servir de substrato para a entrega da solução inseticida para insetos 4. Espuma floral (x 12mm 12mm) pedaços usando uma sonda. Coloque um pedaço de espuma floral no frascos de vidro previamente descritas. Preencha o pipetador repetindo ajustada para entregar 0,5 ml solução e dispensar para a espuma floral. Este volume de líquido deve saturar o pedaço de espuma floral, mas não deve exceder o nível da espuma no frasco. Mais uma vez o trabalho em seqüência a partir do controle (10% em peso de mel: solução de água apenas) e menor para maior concentração.
2.5. Frascos de armazenamento
2.5.1 Teste Vial Adultos para inseticidas de contato
Ao armazenar frascos de inseticida revestido, conhecer as propriedades do inseticida. Inseticidas diferentes têm exigências de armazenamento diferentes, tais como: piretróides são sensíveis à luz e pode ser armazenado em temperatura ambiente, mas no escuro, no entanto, inseticidas organofosforados são sensíveis à temperatura e precisam ser armazenados em um freezer. Se inseticidas devem ser armazenados no freezer, que deve ser aquecido até a temperatura ambiente antes de expor os insetos.2,6 Bioensaio
Coleta dos insetos a serem testados. Este processo pode ser feito usando-feromônio iscas armadilhas, redes de varredura, ou qualquer outro meio de captura em massa. Insetos deve ser mantido por 8-24h para permitir a mortalidade natural de ocorrer para aqueles feridos durante o processo de coleta, fornecer-lhes comida e uma fonte de umidade durante este período. Teste 25/10 insetos por concentração (mínimo de 10); quanto maior o número de insetos testados, o mais robusto conjunto de dados será. Ao selecionar insetos para os bioensaios, escolha saudável, indivíduos ativos e descartar indivíduos letárgicos ou anormal. Insetos lugar nos frascos de tal forma que eles estão expostos a toda a gama das concentrações e não apenas uma concentração de cada vez. Este procedimento irá evitar a colocação dos indivíduos mais saudáveis e ativas em uma ou algumas concentrações. Além disso, se não for possível realizar o experimento com um mínimo de 10 insetos por concentração, expor o maior número possível de cada concentração. Em seguida, coletar insetos mais da área de mesma amostra dentro de um curto período de tempo (2-3 semanas) e repita o experimento. Alguns insetos podem perder susceptibilidade (build resistência) com a progressão da safra e, portanto, a resposta dos indivíduos coletados no início da primavera podem ser diferentes daquelas coletadas no outono 28.
Desenvolver critérios para avaliar mortalidade. Os critérios mais utilizados para classificar os insetos como moribundo ou morto são a falta de movimento coordenado. Essas observações podem incluir a incapacidade de direito em si, se colocados sobre sua superfície dorsal, incapaz de sustentar o vôo coordenado de 1m ou falta de movimento coordenado, quando gentilmente cutucou com um instrumento contundente. Se o indivíduo com o botão direito em si, mas cai, não há movimento coordenado, o inseto deve ser considerada morta. O inseto pode ter dificuldades para se corrigindo em uma superfície lisa e, portanto, ele talvez necessária para suprir o inseto uma superfície de modo que seja capaz de ganhar a tração necessária para a direita em si. Registroo número de sobreviventes e indivíduos mortos para calcular a sobrevivência para cada concentração.
2.6.1 Teste Vial Adultos para inseticidas de contato
Coloque o inseto (s) para o frasco e segura a tampa solta. A tampa precisa impedir que o inseto escape, mas ser solta o suficiente para permitir o fluxo de ar. Para a maioria dos bioensaios de insetos, apenas um inseto é colocado em cada frasco, no entanto, pequenos insetos, por exemplo, ou whiteflies tripes, pode estar exposto a uma taxa de até 30 indivíduos por frasco 6, 15. Colocar os tubos na posição vertical à temperatura ambiente até os insetos são avaliados para a mortalidade no ponto final do bioensaio. Tempos de exposição pode variar com as espécies e, possivelmente, o inseticida 3,5-27. No processo de estabelecimento de níveis de toxicidade inicial com um novo inseto ou químicos, monitorar os assuntos em vários pontos horário agendado após a exposição. Exames podem ser encerrada quando a mortalidade na maior concentração é de 100%, mantendo sobrevivência elevada (<10% de mortalidade) no controle de inseticidas não-tratada. Se a mortalidade de 100% não é alcançado na concentração mais elevada, com alta sobrevivência no controle, o bioensaio deve ser repetido com uma gama de concentrações mais elevadas. Idealmente, os níveis de mortalidade deve aumentar com o aumento da concentração de inseticida.
Alguns insetos, quando expostos por 24 horas, necessitam de uma fonte de umidade (isto é, um pequeno pedaço de material vegetal) 12. Ao trabalhar com um inseto delicado, é benéfico para determinar quanto tempo o inseto pode sobreviver no frasco sem uma fonte de umidade antes da exposição inseticida no teste frasco adulto. Esta informação pode ser determinado pela colocação do inseto em um frasco com e sem uma fonte de umidade e acompanhamento da sua sobrevivência ao longo do tempo antes de realizar as pesquisas inseticida real.
2.6.2 Teste Vial Modificado Adultos para insecticidas sistémicos
Antes do início do bioensaio, determinar se o inseto pode alimentar e sobreviver com espuma floral saturada com o mel: solução de água na ausência de inseticida. Insetos lugar em frascos com espuma floral saturada com mel: só água (ou mel: água com o maior volume de acetona utilizado na preparação de operações de concentração de água não-inseticida solúvel grau técnico) e monitor de sobrevivência durante vários dias. Esta modificação do teste frasco adultos só foi examinada com um Miridae 4 e um Pentatomidae 29 e, portanto, determinar a duração do teste exige mais experimentação do que para o bioensaio insecticida de contacto. Por exemplo, gêneros Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) foi avaliada para a mortalidade em 24 horas após a exposição ao thiamethoxam, mas 72 horas para imidacloprid 4. Mortalidade de Oebalus pugax F. foi avaliada em 96 horas, quando expostos a dinotefuran 29. Portanto, a sobrevivência do inseto em frascos de controle deve ser consistentemente alta por vários dias antes de uma avaliação precisa de mortalidade da intoxicação inseticida pode ser feita.
Coloque o inseto (s) no frasco de cintilação com a espuma floral saturada. Em vez de selar os frascos com tampas, frascos com selo de uma bola de algodão. Colocar os tubos na posição vertical à temperatura ambiente até os insetos são avaliados para a mortalidade. Taxa de mortalidade como mencionado anteriormente, em intervalos regulares. Exame pode ser rescindido quando há 100% de mortalidade na concentração mais elevada com sobrevivência elevada (<10% de mortalidade) no controle. Pode ser necessário testar concentrações adicionais.
2.6.3 Análise de Dados
Correta para a mortalidade no tratamento de controle usando uma fórmula de acordo com a Abbott 30.
Mortalidade corrigida (%) = ((controle% de sobrevivência - a sobrevivência% tratado) / controle sobrevivência%) x 100
Analisar os dados usando probit Dose Log para determinar a concentração letal necessária para matar 50% de uma população (CL 50) e estabelecer intervalos de confiança de 95% (CL). Vários programas de software estão disponíveis para determinar a LC 50 (SAS: PROC PROBIT 31, Polo-Plus 32).
3. Notas
- Trabalhar com acetona e inseticidas sob uma capa de ar negativa de fluxo.
- Ao encher balões volumétricos, é melhor ter duas garrafas de lavagem de acetona. Um frasco de lavagem que foi adaptado para a entrega rápida de líquidos e uma para entrega lento. Remover parte do braço de entrega para criar uma maior abertura e essa garrafa pode ser usado para entrega de um grande volume rapidamente. Uma vez que a acetona se aproxima para a linha de graduação, garrafas de mudar e usar o frasco de lavagem com entrega mais lento para que você tenha mais controle sobre a quantidade que é dispensado. Se um frasco é enchido acima da linha de graduação, deixe a parte superior e deixe evaporar a acetona para a linha de graduação. </ Li>
- Observe a quantidade necessária da solução de reserva, necessário para preparar uma concentração, ou seja, se você encher o balão de ¾ do caminho, mas precisa adicionar 30mls, você pode passar por cima de linha de graduação.
Discussion
A LC 50 valor pode ser usado para estabelecer como base a susceptibilidade de uma população-alvo (s). O valor destes dados pode estar em pesquisas de monitoramento futuro ou para o propósito imediato de comparar os resultados atuais para que de uma LC previamente determinado 50 para determinar a suscetibilidade da população-alvo mudou. LC 50 reais valores podem ser comparados entre as populações através da análise dos intervalos de confiança de 95%, se os limites superiores e inferiores não se sobrepõem, então é provável que a população tem experimentado uma mudança significativa na susceptibilidade e em algumas situações é uma indicação da resistência 33. A LC 50 s também pode ser usado para examinar as mudanças sazonais na inseticida esusceptibilitye 28, ou comparar as respostas entre as espécies ou inseticida AI s. Trabalho considerável também utilizar esses dados para comparar as respostas entre homens e mulheres de 10 ou entre adultos e imaturos, 10,34. Às vezes, intervalos de confiança são amplos ou não capaz de ser calculado. Para obter mais apertado intervalos de confiança de realizar o bioensaio com mais insetos e / ou mais concentrações.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Cotton Incorporated Estado Programa de Apoio # 08-317MO, USDA / CSREES SR-IPM Grant 2009-34103-20018 e Landis Internacional para financiamento de pesquisas referentes a esta publicação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-100 ml glass beaker | |||
| Volumetric flask with stoppers (can use the amber colored flasks for light sensitive pesticides such as pyrethroids) | |||
| 20ml glass scintillation vials with un-lined lids | |||
| A method for color coating vials (paint or markers) | |||
| Acetone | |||
| Commercial hotdog roller (heat element disconnected) | |||
| 2 wash bottles (one modified such that the opening is large for fast delivery of the liquid and one so that the spout opening is small for slow delivery of the liquids) | |||
| Small weigh boat (make sure all plastic materials acetone safe) | |||
| Access to a balance with 0.001g readability or a higher precision. | |||
| Parafilm M | |||
| Repeater pipettor | |||
| Appropriate tips | |||
| Glass pipettes that fit in the volumetric flask. | |||
| Hood (used to remove the acetone smell) | |||
| A place to store insecticide solutions and vials [refrigerator (solutions), dark room or freezer depending on the chemical (vials)] |
References
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