Summary
Este manuscrito demuestra y discute las técnicas utilizadas para estudiar la susceptibilidad de pesticidas y detectar la resistencia a los pesticidas de contacto y sistémicos en las plagas de artrópodos.
Abstract
Resistencia a las plagas a los plaguicidas es un problema cada vez mayor, porque los plaguicidas son una parte integral de la producción agrícola de alto rendimiento. Cuando pocos productos están etiquetados para cada una plaga dentro de un sistema de cultivo en particular, las opciones de control químico son limitadas. Por lo tanto, el mismo producto (s) se utilizan en repetidas ocasiones y la presión de selección continua se coloca sobre la plaga objetivo. Hay costos financieros y ambientales asociados con el desarrollo de poblaciones resistentes. El costo de la resistencia a los plaguicidas se ha estimado en aproximadamente $ 1.5 mil millones anualmente en los Estados Unidos. En este documento se describen los protocolos utilizados actualmente para controlar artrópodos (insectos, específicamente) la población para el desarrollo de resistencia. La prueba vial adulto se utiliza para medir la toxicidad de los insecticidas de contacto y una modificación de esta prueba se utiliza para las plantas insecticidas sistémicos. En estos bioensayos, los insectos son expuestos a insecticidas de calidad técnica y las respuestas (mortalidad) registrada en un determinado intervalo de post-exposición. Los datos de mortalidad son sometidos a análisis de los registros de dosis probit para generar estimaciones de la concentración letal que proporciona la mortalidad en un 50% (LC 50) de las poblaciones objetivo y una serie de límites de confianza (CL) como las estimaciones de la variabilidad de los datos. Cuando estos datos se recogen para una amplia gama de insecticidas susceptibles poblaciones, el CL 50 se puede utilizar como datos de referencia a efectos de control en el futuro. Después de las poblaciones han estado expuestas a los productos, los resultados pueden ser comparados a un determinado previamente LC 50 con la misma metodología.
Protocol
1. Introducción
La producción de alimentos se ha convertido en muy importante con la idea de que para el año 2025 el mundo llegará a una población de 8,04 millones de personas 1. Habrá la necesidad de proporcionar una mayor cantidad de cultivos de alimentos que se produce actualmente. Disponibilidad adecuada de alimentos que no serán capaces sin el uso de productos fitosanitarios, como pesticidas para aumentar la cantidad de rendimiento de los cultivos y mantener la calidad. Sobre la base de la dependencia histórica y actual sobre los plaguicidas, los casos de resistencia a los pesticidas se siguen produciendo y que se informe en la literatura científica.
Resistencia a las plagas a los plaguicidas es un problema porque los productos son un componente integral de la agricultura de calidad de producción de alto rendimiento y alta. Sin embargo, el uso excesivo y / o mal uso de un pesticida puede conducir al desarrollo de resistencia que puede ser perjudicial para la producción de cultivos. Plagas (por ejemplo, los insectos, malas hierbas, patógenos, etc) desarrollar resistencia por una variedad de mecanismos, pero un importante factor para el desarrollo de resistencia es la falta de plaguicidas registrados con un modo independiente de las acciones disponibles para su uso. Cuando pocos productos están etiquetados para cada una plaga dentro de un sistema de cultivo en particular, las opciones de control químico son limitadas. Por lo tanto, el mismo producto químico (s) se utiliza en repetidas ocasiones y la presión de selección continua se coloca sobre la plaga. Este problema se agrava cuando la plaga tiene varias generaciones en un solo año y cada generación se encuentra expuesto al pesticida.
Hay costos financieros y enrivornmental asociadas con la resistencia 2. Resistencia a las plagas lleva a tasas más altas y aplicaciones más frecuentes de los plaguicidas necesarios para lograr un control satisfactorio. Las pérdidas de rendimiento pueden ocurrir incluso después de aumentar el uso de pesticidas debido a la falta de control de la plaga. 2 Pimentel estima que estos costos de la resistencia a los pesticidas en los Estados Unidos a aproximadamente $ 1.5 mil millones anualmente.
Los estudios de susceptibilidad a los plaguicidas entre las poblaciones de plagas es un enfoque proactivo para detectar cualquier cambio en el rendimiento de los insecticidas y proporcionar una alerta temprana para modificar las estrategias de control químico. Mediante la modificación de las estrategias generales de manejo integrado de plagas, la viabilidad de un determinado plaguicida se puede extender, que a su vez, es importante para la agricultura a que sigan prestando suficiente alimento y fibra para el mundo. Este documento describe un protocolo que puede ser usado para monitorear susceptibilidad a los insecticidas y detectar el desarrollo de poblaciones resistentes a los insecticidas mediante la prueba de adultos vial 3 de insecticidas de contacto y una modificación de esta prueba para la planta de insecticidas sistémicos 4.
2. Métodos
2.1 Declaración de seguridad
Utilizando las precauciones apropiadas de seguridad es importante cuando se trata con insecticidas. Consulte la Hoja de Seguridad (MSDS) para el Equipo de Protección Personal (EPP) antes de manipular los pesticidas. La formación específica de laboratorio en el manejo de pesticidas en los laboratorios deben ser requeridos por el personal antes de intentar cualquier bioensayos.
2.2 Realizar la solución de archivo
Desarrollar una solución de archivo de una concentración conocida de una fuente de los ingredientes activos de insecticidas (AI). Todas las concentraciones se desea incluir como tratamientos en el bioensayo se hará a partir de la solución madre original. Por el interés de este trabajo, 100 ml de una 100 mg / ml solución será desarrollada como una solución, sin embargo, las operaciones de concentración se puede diluir de esta concentración inicial. Ajustar la cantidad de AI grado técnico que pesaba sobre la base de la pureza por ciento.
Cantidad a ser pesado = (volumen de hacer) X ([# ug / ml de solución] / [purity/100%])
Por ejemplo, sería necesario 10152.284 mg de técnicas de IA para hacer 100 ml de una 100 mg / ml de solución de un insecticida grado técnico de 98.5% de pureza:
(100 ml) X ([100μg/ml] / 0,985) = 10152.284 mg
2.2.1 Adultos del frasco de insecticidas de contacto
Llene parcialmente un matraz aforado con acetona y se pesa la cantidad ajustada de AI insecticida. Enjuague el barco de peso con acetona en el matraz para eliminar todos los insecticidas desde el barco pesa. Llenar el matraz aforado a la línea de graduación con acetona. La mayoría de las soluciones a cabo en condiciones de refrigeración se mantendrá la actividad sin pérdida apreciable de la eficacia de un mes.
2.2.2 Modificación de la prueba Vial para Adultos de insecticidas sistémicos
Intoxicación de los insectos con insecticidas sistémicos es muy diferente de la de los productos de contacto. Productos sistémicos por lo general deben ser ingeridos por el insecto para ser activo en lugar de los insectos having exposición directa al producto con insecticidas de contacto. Por lo tanto, la prueba de vial para adultos fue modificada a fin de que los insecticidas sistémicos para ser probado. El peso de la AI necesario para la solución de reservas se calcula similar a la que se menciona en la sección 2.2. La metodología es similar, excepto que la IA se disuelve en un 10% de la miel de peso: una solución de agua. Esta solución debe ser hecho dentro de las 24 horas del inicio del bioensayo. Si el material de calidad técnica no es soluble en agua, una alta concentración de la solución de insecticida se puede hacer con acetona de modo que sólo una pequeña cantidad del insecticida: mezcla de acetona se añade a la miel: una solución de agua 4.
2.3 Determinación de las concentraciones de un rango de concentraciones y en desarrollo
La determinación de las concentraciones adecuadas para establecer el rango de respuestas para el bioensayo puede ser difícil. Varias repeticiones puede ser necesario para definir el rango de concentraciones y esto se hace por ensayo y error. Además, el rango puede variar con el tiempo si la población cambia los niveles de susceptibilidad. Muchos otros factores deben ser considerados en el establecimiento de las concentraciones finales e incluyen: la familia de los insectos, la clase de insecticida, el tamaño de los insectos, etc Anteriormente publicó los resultados de las pruebas vial adultos pueden asistir con la selección inicial de las concentraciones de insecticida. Los bioensayos se han publicado: Hemiptera: Aleyrodiidae 5-6, Aphididae 7, Pentatomidae 8-10 y 11-14 Miridae; Thysanaptera: Thripidae 15; Coleoptera: Brentidae 16, Curculionidae 17, 18-19 y Coccinellidae Cybocephalidae 19; Diptera: Culicidae 20, Lepidoptera: Tortricidae 21 y Noctuidae 3, 22-26; Hymenoptera: Braconidae 7,18, Ichneumonidae 26-27, Aphidiidae 18, 7 Encyrtidae y Aphelinidae 18.
Las concentraciones se basan en las "X" ug / ml de solución. Sin embargo, cuando los viales se preparan para el examen vial para adultos, sólo 0,5 ml se añade a cada vial, por lo tanto, la concentración del vial es la mitad de la concentración de hecho. Una vez que las concentraciones son elegidos, de la siguiente ecuación puede ayudar a determinar la cantidad de la solución añadida para hacer la concentración deseada.
(C1) (V1) = (C2) (V2)
Donde C1 es la concentración de la solución madre, V1 es el volumen de las acciones necesarias para que la nueva concentración, C2 es la concentración están preparando, y V2 es el volumen de la nueva concentración. Por ejemplo, 5ml de una solución de reserva 100μg/ml se necesita para hacer un 100 ml de una 5μg/ml. Esta solución 5μg/ml se traduciría en viales recubiertos con una concentración de 2.5μg/vial.
5ml = [(5μg/ml) (100 ml)] / (100μg/ml)
2.3.1 Adultos del frasco de insecticidas de contacto
Llene parcialmente matraz volumétrico, y la parte alícuota de la cantidad calculada de solución de reserva necesario para que la concentración deseada. Llenar el matraz aforado con acetona a la línea de graduación y pasar a la sección 2.4 o el sello de Parafilm M (Alcan Inc, Neenah, WI) para el almacenamiento en el refrigerador para su uso posterior. La mayoría de las soluciones son buenas para un mes.
2.3.2 Modificación de la prueba Vial para Adultos de insecticidas sistémicos
Este proceso es el mismo que se ha mencionado anteriormente en el punto 2.3.1, excepto un 10% de la miel de peso: una solución de agua se sustituye por acetona. Mezcle suficiente miel: una solución de agua para hacer todas las concentraciones deseadas. Estas soluciones deben utilizarse dentro de las 24 horas de preparación.
2.4 Preparación de los Viales
2.4.1 Adultos del frasco de insecticidas de contacto
Si las concentraciones se guarda en el refrigerador, deje que se caliente a temperatura ambiente. El volumen de acetona cambios basados en la temperatura que pueden afectar a la concentración del insecticida. Código de colores de 20 ml viales de vidrio (equipado para los tapones de rosca) para las concentraciones de uso de pintura o los marcadores.
Ajustar una pipeta de repetición para entregar 0.5ml/concentration. Iniciar el trabajo con el control de acetona, siguiendo con la concentración más baja y continuar con concentraciones crecientes hasta que todas las concentraciones se han utilizado. Vierta aproximadamente la mitad del volumen de la solución de que el número real de los viales a tratar (es decir, 20mls de 40 viales) en un vaso pequeño. Cuando la solución no está en uso, se cubre para minimizar la evaporación que puede causar cambios en la concentración. Dibuje la solución de insecticida en la pipeta de repetición y prescindir de la solución 0,5 ml en ampollas de vidrio individuales.
Inmediatamente después del tratamiento, los frascos de vidrio se colocan en un rodillo de salchicha comercial. Como el cambio rodillos, frascos de vidrio rota y se evapora la acetona, dejando el interior del frasco cubierto con la técnicaal grado de insecticida. El calor pueden degradar los insecticidas, por lo tanto, es importante que el calor que se fuera. Esto se puede hacer ya sea mediante la desconexión de la resistencia en un modelo que se calienta y los rollos al mismo tiempo y es controlado por el mismo interruptor o mediante el uso de un modelo de rodillo de perros calientes que tiene funcionando independientemente interruptores para el elemento de calefacción y los rodillos. Evitar tratar a más viales que tiene el rodillo, la acetona puede evaporarse antes de que los viales de vidrio se rotan y no puede recibir una capa uniforme en las paredes del vial.
Permitir que los viales de girar hasta que la acetona se ha evaporado. Hay tal vez una fina capa de acetona-condensación en las paredes del vial, por lo tanto, los viales deben ser examinados de forma individual. Tiempo necesario para rodar viales varía en función de las condiciones de laboratorio. Una vez que los viales se tapa seca, y almacenarlos, ya sea en condiciones de frío o la oscuridad. Los insectos se han observado en reposo en las tapas con revestimiento de forma cónica o revestimientos de papel rasgado que cuelgan por debajo del borde del vial (es decir, evitar las superficies tratadas), por lo tanto, es importante utilizar sin tapas forradas.
Cualquier resto de solución no se utiliza para preparar los viales deben ser eliminados adecuadamente. La solución restante en el matraz aforado puede ser sellado con Parafilm y se almacena en el refrigerador. Fecha de los viales cuando están preparados, como los insecticidas diferentes tienen una vida útil diferente. Por ejemplo, los piretroides recubiertos viales son buenos para aproximadamente un mes, mientras que los viales revestidos con un insecticida más inestable, como un organofosforado, tienen una vida útil de dos semanas o menos.
2.4.2 Adultos modificación del frasco de insecticidas sistémicos
Espuma floral que se necesita para servir como sustrato para la entrega de la solución de insecticida a los insectos 4. Corta la espuma floral (X 12mm 12mm) piezas mediante una sonda. Coloque un trozo de espuma floral en los viales de vidrio se ha descrito anteriormente. Llenar la pipeta de repetición ajustado para ofrecer una solución de 0,5 ml y prescindir en la espuma floral. Este volumen de líquido debe saturar el trozo de espuma floral, pero no debe exceder el nivel de la espuma en el vial. Una vez más el trabajo en la secuencia del control (10% en peso de la miel: una solución de agua solamente) y de menor a mayor concentración.
2.5. Viales almacenar
2.5.1 Adultos del frasco de insecticidas de contacto
Al almacenar los viales revestidos insecticida, conocer las propiedades de los insecticidas. Insecticidas tiene diferentes necesidades de almacenamiento, tales como: los piretroides son sensibles a la luz y se puede almacenar a temperatura ambiente, pero en la oscuridad, sin embargo, los insecticidas organofosforados son sensibles a la temperatura y se deben almacenar en un congelador. Si los insecticidas deben ser almacenados en el congelador, que debe ser calentado a temperatura ambiente antes de exponer a los insectos.2.6 Bioensayo
Recoger los insectos para ser probado. Este proceso se puede hacer uso de feromonas con cebo de las trampas, redes de barrido, o cualquier otro medio de captura masiva. Los insectos se mantuvieron durante 8-24h para permitir que la mortalidad natural que ocurrir para que las personas heridas durante el proceso de recolección, les proporcionan alimentos y una fuente de humedad durante este período. 25.10 Prueba de insectos por la concentración (10 mínimo), cuanto mayor sea el número de insectos a prueba, la más sólida del conjunto de datos será. Al seleccionar insectos para el bioensayo, seleccione los individuos sanos, activos y descartar los individuos letárgico o anormal. Insectos a cabo en los viales de tal manera que están expuestos a toda la gama de las concentraciones y no sólo una concentración a la vez. Este procedimiento evitará la colocación de los individuos más sanos y activos en uno o una concentración de unos pocos. Además, si no es posible llevar a cabo el experimento con un mínimo de 10 insectos por la concentración, la exposición al mayor número posible de cada concentración. A continuación, recoger más insectos de la zona de la misma muestra en un corto período de tiempo (dos o tres semanas) y repetir el experimento. Algunos insectos pueden perder la sensibilidad (construir la resistencia) a medida que avanza la temporada de cultivo, por lo tanto, la respuesta de los individuos capturados en el principio de la primavera pueden ser diferentes de los recogidos en el otoño de 28.
Desarrollar criterios para evaluar la mortalidad. Los criterios más utilizados para clasificar los insectos, moribundos o muertos son la falta de movimiento coordinado. Estas observaciones pueden incluir la incapacidad de derecho en sí mismo si se colocan en la superficie dorsal, incapaz de mantener un vuelo coordinado de 1m o la falta de movimiento coordinado al tacto pinchó con un objeto contundente. Si el individuo puede hacer en sí, sino se cae, no hay ningún movimiento coordinado, el insecto debe ser considerado muerto. Los insectos pueden tener dificultades para corregir en sí sobre una superficie resbaladiza, por lo tanto, podría ser necesario para abastecer el insecto una superficie de modo que sea capaz de ganar la tracción necesaria para enderezarse. Registroel número de supervivientes y de los individuos muertos para el cálculo de la supervivencia para cada concentración.
2.6.1 Adultos del frasco de insecticidas de contacto
Lugar del insecto (s) en el vial y asegurar la tapa suelta. La tapa tiene que evitar que el insecto se escape, pero suficientemente sueltas como para permitir el flujo de aire. Para la mayoría de los bioensayos de insectos, sólo un insecto se coloca en el vial, sin embargo, los pequeños insectos, moscas blancas, por ejemplo, o trips, puede estar expuesto a una velocidad de hasta 30 individuos por vial 6, 15. Colocar los viales en posición vertical a temperatura ambiente hasta que los insectos son evaluados para la mortalidad en el punto final del bioensayo. Los tiempos de exposición pueden variar según la especie y, posiblemente, el insecticida 3,5-27. En el proceso de establecimiento de los niveles iniciales de toxicidad con un nuevo insecto o químico, vigilar los sujetos en múltiples puntos de tiempo programado después de la exposición. Los exámenes pueden ser terminados en la mortalidad a la concentración más alta es 100% mientras se mantiene alta supervivencia (mortalidad <10%) en el control no tratados con insecticidas. Si el 100% de mortalidad no se alcanza a la mayor concentración con alta supervivencia en el control, el bioensayo debe repetirse con un intervalo de concentraciones más altas. Idealmente, los niveles de mortalidad debería aumentar a medida que aumenta la concentración de insecticida.
Algunos insectos, cuando se expone durante 24 horas, requieren de una fuente de humedad (es decir, una pequeña pieza de material vegetal) 12. Cuando se trabaja con un insecto delicado, es beneficioso para determinar el tiempo que el insecto puede sobrevivir en el vial sin una fuente de humedad antes de la exposición a los insecticidas en la prueba de vial para adultos. Esta información se puede determinar mediante la colocación de los insectos en un frasco con y sin una fuente de humedad y el seguimiento de su supervivencia en el tiempo antes de la realización de las encuestas de los insecticidas actuales.
2.6.2 Adultos modificación del frasco de insecticidas sistémicos
Antes del inicio del bioensayo, determinar si el insecto pueda alimentarse y sobrevivir en la espuma floral saturado con la miel: una solución de agua en ausencia de insecticidas. Insectos a cabo en viales con espuma floral saturado con miel: sólo agua (o la miel: el agua con el mayor volumen de acetona utilizada en la preparación de las operaciones de concentración que no utilicen agua insecticida soluble de calidad técnica) y el monitor de supervivencia para varios días. Esta modificación de la prueba de vial para adultos sólo se ha examinado con un 4 y un Miridae Pentatomidae 29, por lo tanto, determinar la duración de la prueba requiere más experimentación que en el bioensayo de insecticida de contacto. Por ejemplo, Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) Se evaluó la mortalidad a las 24 horas después de la exposición al tiametoxam, pero 72 horas para imidacloprid 4. La mortalidad de los Oebalus pugax F. se evaluó a las 96 horas cuando se expone a dinotefuran 29. Por lo tanto, la supervivencia de los insectos en viales de control debe ser consistentemente altos durante varios días antes de una clasificación precisa de mortalidad por intoxicación con insecticidas se pueden hacer.
Lugar del insecto (s) en el vial de centelleo con la espuma floral saturadas. En vez de sellar los frascos con tapa, sello viales con una bola de algodón. Colocar los viales en posición vertical a temperatura ambiente hasta que los insectos son evaluados para la mortalidad. Como se mencionó anteriormente, la tasa de mortalidad a intervalos regulares. El examen se puede terminar cuando hay una mortalidad del 100% en la concentración más alta, con alta supervivencia (mortalidad <10%) en el control. Puede que sea necesario para poner a prueba las concentraciones adicionales.
2.6.3 Análisis de Datos
Correcta de la mortalidad en el tratamiento de control con una fórmula de acuerdo con Abbott 30.
Mortalidad corregida (%) = ((% de control de supervivencia - Survival% de los tratados) / control% de supervivencia) x 100
Analizar los datos mediante probit Entrar dosis para determinar la concentración letal para matar al 50% de la población (CL 50) y establecer intervalos de confianza del 95% (CL). Múltiples programas de software están disponibles para determinar la CL 50 (SAS: PROC PROBIT 31, Polo-Plus 32).
3. Notas
- Trabajar con acetona y los insecticidas bajo una campana de aire negativa de flujo.
- Al llenar matraces aforados, lo mejor es tener dos botellas de lavado de acetona. Un lavado de botella que ha sido adaptado para la entrega rápida de líquidos y una para la entrega lenta. Quitar parte del brazo de entrega para crear una abertura más grande y esta botella se puede utilizar para la entrega de un gran volumen rápidamente. Una vez que la acetona se acerca a la línea de graduación, las botellas de cambio y el uso de la botella de lavado con un menor de entrega para que usted tenga más control sobre la cantidad que se dispensa. Si el matraz se llena por encima de la línea de graduación, deja la parte superior y deje evaporar la acetona a la línea de graduación. </ Li>
- Tenga en cuenta la cantidad necesaria de la solución, necesaria para preparar una concentración, es decir, si usted llena el frasco de ¾ del camino, pero necesita agregar 30ml, usted puede ir sobre la línea de graduación.
Discussion
El valor de LC50 se puede utilizar para establecer como línea base de susceptibilidad de una población objetivo (s). El valor de estos datos puede estar en las encuestas de seguimiento futuro o para el propósito inmediato de comparar los resultados actuales con la de un determinado previamente LC 50 para determinar la susceptibilidad de la población objetivo ha cambiado. Real CL 50 valores se pueden comparar entre las poblaciones mediante el examen de los intervalos de confianza del 95%, si los límites superior e inferior no se superponen, entonces es probable que la población ha experimentado un cambio significativo en la susceptibilidad y en algunos casos es una indicación de la resistencia 33. La LC 50 s también se puede utilizar para examinar los cambios estacionales en los insecticidas esusceptibilitye 28, o comparar las respuestas entre las especies o insecticida AI s. Una labor considerable también utilizan estos datos para comparar las respuestas entre hombres y mujeres de 10 o entre los adultos y estados inmaduros, 10,34. A veces, los intervalos de confianza son amplios o no puede ser calculado. Para obtener más estrictos los intervalos de confianza realizar el bioensayo con más insectos y las concentraciones / o más.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Cotton Incorporated Programa de Apoyo Estatal # 08-317MO, USDA / CSREES SR-IPM subvención 2009-34103-20018 y Landis internacional para financiar la investigación relativa a esta publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-100 ml glass beaker | |||
| Volumetric flask with stoppers (can use the amber colored flasks for light sensitive pesticides such as pyrethroids) | |||
| 20ml glass scintillation vials with un-lined lids | |||
| A method for color coating vials (paint or markers) | |||
| Acetone | |||
| Commercial hotdog roller (heat element disconnected) | |||
| 2 wash bottles (one modified such that the opening is large for fast delivery of the liquid and one so that the spout opening is small for slow delivery of the liquids) | |||
| Small weigh boat (make sure all plastic materials acetone safe) | |||
| Access to a balance with 0.001g readability or a higher precision. | |||
| Parafilm M | |||
| Repeater pipettor | |||
| Appropriate tips | |||
| Glass pipettes that fit in the volumetric flask. | |||
| Hood (used to remove the acetone smell) | |||
| A place to store insecticide solutions and vials [refrigerator (solutions), dark room or freezer depending on the chemical (vials)] |
References
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