Cella Transfection singola in embrioni di pollo

Summary

Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Abstract

Un tema centrale in biologia dello sviluppo è la diversificazione delle linee e la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base. Ciò comporta un'analisi approfondita dei destini di singole cellule in condizioni normali e sperimentali. A tal fine, i metodi di trasfezione che l'obiettivo progenitori singole sono un prerequisito. Descriviamo qui un metodo tecnicamente semplice per trasfezione singole cellule nei tessuti pollo in-ovo, permettendo lignaggio tracciamento affidabile così come la manipolazione genetica. Domini tessuto specifici sono mirati all'interno del somite o tubo neurale, e il DNA è iniettato direttamente nel epitelio di interesse, con conseguente trasfezione sporadici di singole cellule. Utilizzando i giornalisti, le popolazioni clonale può quindi essere fatta per un massimo di tre giorni, e il comportamento delle popolazioni geneticamente manipolati clonale può essere paragonata a quella dei controlli. Questo metodo sfrutta l'accessibilità del embrione di pollo con strumenti emergenti per la manipolazione genetica. Noi confrontare e discutere i vantaggi rispetto al metodo ampiamente utilizzato elettroporazione, e le possibili applicazioni e l'uso in ulteriori in-vivo i modelli sono inoltre suggerito. Noi sosteniamo l'utilizzo di questo metodo come un'aggiunta significativa e complemento per lignaggio tracciamento e gli strumenti esistenti interferenze genetiche.

Protocol

1. Preparazione del Micropipette

Tiriamo le nostre pipette su un Narishige standard di pp-83 pipetta estrattore con una regolazione di calore di 13,5. La regolazione precisa deve essere calibrato, mirando ad un diametro di punta della pipetta tra gli 8 ei 10 micron. Noi usiamo filamento contenenti tubi in vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,0 mm e diametro interno 0,75-0,78 mm. Le pipette sono quindi memorizzati in un piatto di plastica con le punte protetto dal contatto con i bordi del piatto.

2. Preparazione del DNA

Il plasmide di interesse è transfettate in DH5α E. coli utilizzando le procedure standard. Culture durante la notte da singole colonie sono utilizzati per purificare il plasmide con maxi-prep kit (ogni kit commerciale dovrebbe fare). Usiamo un plasmide concentrazione di 1,0 mg / mL per i non-clonale iniezioni. Concentrazioni più elevate aumentano l'intasamento di puntali. Per le applicazioni clonale, le concentrazioni plasmide sono molto più bassi e deve essere regolato (vedi sotto). Per pCAGG-GFP, la concentrazione ottimale producendo risultati clonale è risultato essere di circa 0,05-0,1 mg / mL. Uno a 2 l di plasmide è tipicamente usato per esperimento, e una quantità minima di fast-verde in polvere (aderendo alla punta di una secca, pipetta di vetro taglienti) viene aggiunto il plasmide prima l'esperimento comincia. Il plasmide viene poi immesso in una centrifuga da tavolo per 2 minuti a velocità massima. Questa procedura sembra ridurre pipetta-problemi di intasamento.

3. Iniezione di embrioni

3.1 Preparazione di embrioni

Noi usiamo quaglia e uova di gallina per preparazioni iniettabili. Le uova vengono incubate sdraiato sul loro asse lungo fino alla fase di sviluppo desiderato. Le uova sono tamponate con etanolo al 70% e lasciato asciugare. L'estremità appuntita dell'uovo è trafitto con le forbici chirurgiche (questo è necessario solo in uova di gallina) e 1 mL (a quaglie) o 2 ml (pulcino) di albume è tratto da l'uovo con una siringa da 10 ml (19G ago). I fori vengono poi sigillati con paraffina calda.

Prima dell'iniezione attuale, si apre una finestra nella parte superiore del guscio d'uovo con le forbici chirurgiche. Posizionamento nastro adesivo sopra la conchiglia e il taglio attraverso di essa può contribuire a ridurre i detriti dalla shell. Tampone PBS contenente antibiotici è pipettati immediatamente nell'uovo. Per accedere l'embrione, la vitellina e / o membrane amniotiche sono tagliati e deviato con perni di insetti 0,14 mm montato su una porta aghi. Inchiostro atossico (Pelican # 17) viene iniettato sotto la Blastoderm per aiutare a visualizzare l'embrione, utilizzando un fuoco tirato capillare montato su un aspiratore.

3.2 Caricamento e montaggio di micropipette

L'estrattore micropipette possono essere caricati con il plasmide di fuoco tirato capillari di adeguato diametro, montato su un aspiratore. Una quantità minima di plasmide viene disegnato con il capillare e caricato nella pipetta dal suo opposto, l'apertura alla punta affilata, e si avvicina la punta da dentro il più possibile. La pipetta è quindi caricato su una pressione manuale iniettore montato su un micromanipolatore. Pressione minima si applica, se necessario, al fine di consentire la soluzione di plasmide per raggiungere la punta della pipetta.

3,3 iniezione plasmidi

La pipetta è manipolato in ambiente liquido dell'uovo, mentre applicando una certa pressione d'aria per evitare l'intasamento del puntale. Il dominio del tessuto rilevante è trafitto. La variazione di pressione come la punta entra nel tessuto è spesso sufficiente per rilasciare plasmide con verde visibile veloce. Se questo non è il caso, applicare una leggera pressione sulla siringa fino a quando il plasmide / veloce verdi sono espulsi. Questo processo può essere ripetuto lungo l'asse dell'embrione, ad esempio in somiti adiacenti o lungo la portata del tubo neurale. A seguito di iniezioni, PBS può essere aggiunto. La finestra è sigillata con nastro adesivo (parafilm non è auspicabile soprattutto per le uova di quaglia, che aumenta i tassi di morte dell'embrione, probabilmente bloccando lo scambio di ossigeno attraverso la shell). Gli embrioni trattati sono tornato a un incubatore. Evitare di ventilazione e luogo piccoli contenitori con l'acqua in incubatrice poiché aiutano a mantenere l'umidità e aumentare le rese.

4. La regolazione dei parametri di iniezione e monitoraggio Percentuali di successo

Asessing e calibrare i parametri di iniezione diversi è fondamentale per le applicazioni volte a cella singola analisi. Non tutti gli eventi iniezione porterà ad etichettatura di successo di una singola cella. Concentrazione plasmide che è troppo alto può portare a non clonale etichettatura, mentre molto basso risultato concentrazioni elevate percentuali di insuccesso. La concentrazione del plasmide iniettato deve essere ottimizzato per le iniezioni clonale. Si consiglia la diluizione dell'intero magazzino plasmide purificato piuttosto che diluire prepara individuo a una determinata concentrazione. Quest'ultimopotrebbe introdurre alcuni varianza dei tassi di successo, probabilmente dovuto alle variazioni di purezza e di altri parametri come la percentuale di plasmide superavvolto.

4,1 i tassi di successo Valutazione osservazione diretta integrale montaggio

La valutazione iniziale di embrioni iniettati possono essere eseguite da tutto il montaggio di osservazione con un binocolo fluorescente. Da sei a otto ore dopo l'iniezione sono sufficienti per valutare le percentuali di successo con un pCAGG avanzata costruire GFP. Questo è fornito il sito di destinazione è abbastanza superficiale da risultare evidente (ad esempio il somite dorsale, dorsale del tubo neurale, ecc ectoderma, vedi Figura 1A-C).. Questa fase è particolarmente utile per la valutazione sperimentale della serie espositiva sia troppe cellule etichettate o, in alternativa, mancando di cellule fluorescenti. Se si desidera ulteriore incubazione, antibiotici soluzione contenente PBS deve essere aggiunto l'uovo, dopo la visualizzazione e il nastro di tenuta deve essere sostituito.

4,2 clonalità Valutare da serial-sezione di analisi

Il modo migliore per valutare i tassi di iniezioni di successo è da serie-sezionamento e l'utilizzo di embrioni iniettati immunoistochimica per visualizzare le cellule etichettati. In queste condizioni, tempi di incubazione possono essere il più breve di 4 ore dopo l'iniezione. Gli embrioni sono fissi e trattati per sezionamento paraffina (o criosezionamento). Vetro montati sezioni sono poi de-paraffinized e immuno-colorato per la visualizzazione reporter. Metodi di amplificazione come biotina-streptavidina potrebbe essere auspicabile. Infine, le sezioni seriali vengono analizzati per rilevare le cellule etichettate in segmenti iniettato. Se a seguito di prove iniziali di più piuttosto che singole cellule si ottengono, lo stock plasmide deve essere diluito e il processo ripetuto fino a quando si ottengono risultati adeguati. Da due a 10 volte diluizioni della soluzione madre plasmide può essere necessaria in caso di tassi di successo troppo elevata.

Per ogni plasmide di essere transfettate, una calibrazione completa che garantisce clonalità dovrebbe essere ripetuto.

5. Rappresentante Risultati

Noi di solito effettuare una singola iniezione di pCAGG-GFP per somite, avendo cura di individuare i segmenti 6-12 per ogni embrione ^{1 2.} Con questa impostazione, un chiaro segnale può essere rilevato da tutta l'osservazione montare 8 ore dopo l'iniezione, in almeno un segmento di un embrione su dieci. In queste condizioni, l'etichettatura è stata ulteriormente confermata da clonale (Figura 1B, C). Quando si utilizzano elevate concentrazioni di DNA, la maggior parte degli embrioni possono presentare almeno una iniezione di successo, aumentando la possibilità che più celle sono state transfettate.

Analisi sezione seriale ha rivelato che trasfezioni clonale sono stati raggiunti quando il tasso di successo era del 10%. Questo significa che per raggiungere clonalità, la tecnica è per definizione, altamente inefficiente. D'altra parte, in queste condizioni, oltre il 93% degli eventi etichettatura positivi sono risultati essere clonale ^1.

Figura 1. Iniezioni clonale di pCAGGS-GFP in progenitori neurali e scheletrico. (AC) sezioni trasversali che mostra l'etichettatura del tubo neurale dorsale (NT) (A), dominio ventrolaterale del dermomyotome (DM) (B), o centrale foglio DM (C) , 6 ore dopo la microiniezione di pCAGGS-GFP per un solo progenitore. (D) Due giorni dopo la transfezione clonale del DM centrale, progenitori singolo generato derivati ​​sia derma (D), così come muscolare (M) (vedi rif. ¹ per i dettagli).

Discussion

Il metodo descritto sopra è una modifica di una tecnica descritta in precedenza per la consegna di coloranti lipofilici a sottoinsiemi di cellule piccole o progenitori singolo ^3. Ha tre vantaggi principali rispetto alla tecnica standard di elettroporazione. In primo luogo, fornisce un mezzo per l'etichettatura con siti discreta fiducia nei tessuti bersaglio, consentendo maggiore risoluzione spaziale di elettroporazione (vedi ad esempio Figura 1B, C). In secondo luogo, permette l'etichettatura delle singole cellule, permettendo di tracciare il loro lignaggio in vivo in condizioni normali altrimenti ^{1 2} (Figura 1 C, D). In terzo luogo, miss-espressione del gene a livello di singola cellula fornisce uno strumento per indagare i meccanismi molecolari di segregazione lignaggio, per studiare il ruolo dei fattori di crescita o di altri geni sul comportamento cellulare in un contesto altrimenti normale, ecc Pertanto, questo metodo è complementare la tecnica di elettroporazione ampiamente applicata, e sfrutta ulteriormente l'accessibilità dell'embrione aviaria a spazio-temporalmente guadagno regolato e la perdita della funzione del gene in vivo.

Una domanda sempre più rilevante è l'analisi dei comportamenti cellulari a livello di singola cellula (migrazione cellulare, guida assonale, la divisione cellulare, ecc) utilizzando nuove tecnologie di imaging dal vivo ^{4 5 6 7.} In alcune di queste impostazioni sperimentali, potrebbe essere opportuno utilizzare una rapida attivazione specie giornalista (come Venere-GFP) ⁸ in modo da consentire una visualizzazione precedente della cellula iniettata.

Data la semplicità del metodo qui descritto, è molto probabile che possa essere applicato anche ad altri modelli animali, come Zebrafish e Xenopus. Il sistema è molto facile da configurare e utilizzare, e la difficoltà principale sta generando serie sufficientemente grande di embrioni etichettati, così come la scansione per la progenie etichettati in applicazioni che richiedono un serial-sezioni. Nelle nostre mani, le cellule iniettate esposto un segnale GFP facilmente rilevabile per un massimo di 3 giorni, ma questo parametro è probabile che dipendono dai tassi di proliferazione cellulare. Utilizzando un giornalista di lunga durata come il Lac-Z, o trasposoni-mediato trasferimento genico che consentano un'integrazione stabile ^9, potrebbe essere possibile per prolungare tracciamento della progenie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B