Summary
استخدام غيض غرامة micropipettes نحن حقن الحمض النووي البلازميد في المجالات الفرعية من somites الدجاج أو أنابيب العصبية. يتم ضبط تركيز البلازميد لتوليد خلايا transfected واحد. ثم نسمح لتطوير الخلايا في نسيلي السكان.
Abstract
وثمة موضوع محوري في البيولوجيا التطورية هو تنويع الأنساب والكشف عن الآليات الجزيئية الكامنة وراءها. هذا ينطوي على تحليل دقيق لمصير الخلايا واحد في ظل الظروف العادية والتجريبية. تحقيقا لهذه الغاية ، وأساليب ترنسفكأيشن التي تستهدف الأسلاف واحد ، هو شرط مسبق. نحن هنا وصف طريقة بسيطة من الناحية الفنية لtransfecting الخلايا في الأنسجة واحدة الدجاج داخل البيضة ، مما يتيح تتبع النسب موثوق بها ، فضلا عن التلاعب الجيني. وتستهدف مجالات محددة داخل النسيج الجسيدة أو الأنبوب العصبي ، ويتم حقن الحمض النووي مباشرة في ظهارة من الفائدة ، مما أدى إلى ترنسفكأيشن متفرقة من الخلايا واحد. قد تستخدم للصحفيين ، وبالتالي السكان نسيلي أن تعزى لمدة تصل إلى ثلاثة أيام ، ويمكن مقارنة سلوك السكان نسيلي التلاعب وراثيا مع أن من الضوابط. هذا الأسلوب تستفيد من سهولة الحصول على الجنين الفرخ جنبا إلى جنب مع الأدوات التي تبرز للتلاعب الجيني. قارنا ومناقشة مزاياه على طريقة electroporation على نطاق واسع المستخدمة ، والتطبيقات الممكنة واستخدام النماذج في داخل الجسم الحي إضافية واقترحت أيضا. ندعو إلى استخدام هذه الطريقة بمثابة إضافة هامة ومكملة لتعقب النسب الحالية وأدوات التدخل الجيني.
Protocol
1. إعداد Micropipettes
نحن لدينا سحب ماصات على Narishige القياسية مجتذب ماصة PP - 83 مع إعداد الحرارة من 13.5. ويجب معايرة الإعداد الدقيق ، بهدف قطره غيض ماصة بين 8 و 10 ميكرون. نحن نستخدم خيوط المحتوية على أنابيب زجاجية البورسليكات مع القطر الخارجي من 1.0 ملم وقطرها الداخلي 0،75-0،78 مم. يتم تخزين بالتالي ماصات في طبق من البلاستيك مع نصائح محمية من الاتصال مع حواف الصحن.
2. الحمض النووي التحضير
هو transfected في البلازميد من الاهتمام إلى E. DH5α القولونية باستخدام الاجراءات القياسية. تستخدم الثقافات بين عشية وضحاها من المستعمرات واحد لتنقية البلازميد باستخدام ماكسي الإعدادية مجموعات (أي مجموعة تجارية ينبغي القيام به). نستخدم تركيز البلازميد من 1.0 ميكروغرام / ميكرولتر لغير نسيلي الحقن. تركيزات أعلى زيادة انسداد نصائح ماصة. لتطبيقات نسيلي ، البلازميد تركيزات أقل بكثير ، ويجب تعديلها (أنظر أدناه). لpCAGG - GFP ، عثر على تركيز الأمثل تسفر عن نتائج نسيلي أن يكون حوالي 0،05-0،1 ميكروغرام / ميكرولتر. وعادة ما تستخدم واحد إلى 2 ميكرولتر من البلازميد في التجربة ، ويتم إضافة كمية صغيرة من مسحوق سريع الخضراء (التمسك غيض من الجاف ، ماصة الزجاج الحادة) إلى البلازميد يبدأ قبل التجربة. وطرد بعد ذلك في جهاز للطرد المركزي البلازميد الطاولة لمدة 2 دقيقة على السرعة القصوى. يبدو هذا الإجراء للحد من مشاكل انسداد ماصة.
3. حقن الأجنة
3.1 التحضير للأجنة
نستخدم السمان فضلا عن حقن بيض الدجاج. يتم تحضين البيض ملقاة على المحور الطويل حتى المرحلة التنموية المنشودة. وممسوح البيض مع الايثانول 70 ٪ ، وسمح لتجف. غير مثقوب نهاية وأشار من البيض مع مقص جراحي (وهذا أمر ضروري إلا في بيض الدجاج) و 1 مل (في السمان) أو 2 مل (فرخ) من الزلال ويوجه من البيض مع حقنة 10 مل (19G إبرة). ثم يتم اغلاق الفتحات مع البارافين الساخن.
قبل الحقن الفعلية ، يتم فتح نافذة في الجزء العلوي من قشرة البيضة باستخدام مقص جراحي. يمكن وضع شريط لاصق على قذيفة والقطع من خلال ذلك يساعد على تقليل الحطام من قذيفة. هو برنامج تلفزيوني pipetted العازلة التي تحتوي على المضادات الحيوية على الفور الى البويضة. للوصول إلى الجنين ، ويتم قطع المحي / أو الأغشية السلوية وحولت باستخدام دبابيس 0.14 ملم الحشرات التي شنت على حامل الإبرة. ويتم حقن الحبر غير سامة (البجع # 17) تحت الأريمة تصور لمساعدة الجنين ، وذلك باستخدام لإطلاق النار وانسحبت الشعرية التي شنت على الشافطة.
3.2 تحميل وتركيب micropipettes
يمكن تحميل micropipettes مجتذب مع البلازميد بواسطة الشعيرات الدموية لاطلاق النار وانسحبت قطر من كافية ، وشنت على an الشافطة. يتم رسم الحد الأدنى من استخدام البلازميد الشعري وتحميلها في ماصة العكس من افتتاحه إلى الطرف شحذ ، والاقتراب من الحافة من الداخل إلى أقصى حد ممكن. يتم تحميل ماصة بالتالي في الصعود إلى ضغط الهواء دليل حاقن شنت على micromanipulator. يتم تطبيق الحد الأدنى من الضغط ، إذا لزم الأمر ، من أجل السماح للوصول إلى حل البلازميد غيض من ماصة.
3.3 حقن البلازميد
ماصة يتم التلاعب في المتوسط السائل من البيض في حين تطبيق بعض الضغط الجوي لمنع انسداد رأس ماصة. واخترقت المجال الأنسجة ذات الصلة. التغيير في الضغط على الطرف يدخل في نسيج وغالبا ما يكفي لاطلاق سراح البلازميد مع الأخضر سريع مرئية. إذا لم تكن هذه هي الحالة ، تطبق ضغط خفيف إلى حقنة حتى يتم طرد الأخضر البلازميد / سريع. ويمكن تكرار هذه العملية على طول محور الجنين ، على سبيل المثال في somites المجاورة أو على طول مدى الأنبوب العصبي. بعد الحقن ، يمكن إضافة برنامج تلفزيوني. وأغلقت النافذة باستخدام شريط لاصق (parafilm غير مرغوب فيه خاصة بالنسبة للبيض السمان أنه يزيد معدلات الوفاة الجنين ، وربما عن طريق منع تبادل الاوكسجين من خلال قذيفة). يتم إرجاع الأجنة المعالجة إلى حاضنة. تجنب التهوية ومكان عبوات صغيرة مع الماء في الحاضنة كما يساعد في الحفاظ على الرطوبة وزيادة الغلة.
4. ضبط معلمات حقن ورصد معدلات النجاح
Asessing ومعايرة معلمات الحقن المختلفة للتطبيقات الحرجة بهدف وحيد الخلية التحليل. وليس كل حال الحقن يؤدي إلى وضع العلامات الناجحة من خلية واحدة. ويمكن تركيز البلازميد وهي نسبة مرتفعة جدا تؤدي إلى عدم نسيلي الوسم ، بينما تركيزات منخفضة جدا نتيجة الفشل في معدلات عالية. يجب أن يكون الأمثل للتركيز على البلازميد حقن لحقن نسيلي. نوصي التخفيف من كامل رصيد البلازميد المنقى بدلا من تمييع محضرات الفردية إلى تركيز محدد مسبقا. هذا الأخيرربما تدخل بعض التباين في معدلات النجاح ، وربما يرجع الى اختلافات في الطهارة وغيرها من المعالم مثل نسبة البلازميد supercoiled.
4.1 تقييم معدلات النجاح عن طريق الملاحظة جبل بأكمله
يمكن إجراء تقييم أولي للأجنة من خلال حقن كله يشن تحت مجهر المراقبة الفلورسنت. ست الى ثماني ساعات بعد الحقن كافية لتقييم معدلات النجاح مع بناء GFP pCAGG محسنة. يتم توفير هذا الموقع المستهدف هو سطحي يكفي ليكون واضحا بسهولة (مثل الجسيدة الظهرية ، الأنبوب العصبي الظهري ، الخ الأديم الظاهر ، انظر الشكل 1A - C). هذه الخطوة هي مفيدة بشكل خاص لتقييم المعرض سلسلة تجريبية كثيرة جدا إما خلايا المسمى أو بدلا من ذلك ، تفتقر إلى أية خلايا الفلورسنت. إذا كان المطلوب مزيد من الحضانة ، يجب إضافة المضادات الحيوية المحتوية على حل PBS إلى البويضة بعد عرض ويجب أن يتم استبدال الشريط الختم.
4.2 قابلية التنسيل تقييم من قبل قسم التحليل التسلسلي
أفضل وسيلة لتقييم معدلات الحقن الناجحة هي بالتسلسل sectioning الأجنة واستخدام حقن المناعية لتصور خلايا المسمى. في ظل هذه الظروف ، يمكن مرات الحضانة تكون قصيرة بقدر 4 ساعات بعد الحقن. يتم إصلاح الأجنة ومعالجتها للsectioning البرافين (أو cryosectioning). زجاج المركبة المقاطع ثم يتم اجتثاث paraffinized والمناعية الملون لرؤية المراسل. قد أساليب التضخيم مثل البيوتين streptavidin يكون مرغوبا فيه. أخيرا ، يتم فحص الأجزاء المتسلسلة للكشف عن خلايا المسمى في قطاعات حقن. إذا بناء على التجارب الأولية ويتم الحصول على خلايا متعددة بدلا من واحدة ، يجب أن يكون السهم المخفف البلازميد والعملية تتكرر حتى يتم تحقيق نتائج كافية. يجوز لاثنين إلى 10 أضعاف التخفيفات المخزون من الحل البلازميد تكون ضرورية في حالات معدلات نجاح مرتفعة جدا يجري.
عن أن تكون كل transfected البلازميد ، ينبغي تكرار المعايرة شامل يضمن قابلية التنسيل.
5. ممثل النتائج
نحمل عادة من حقنة واحدة من pCAGG - GFP في الجسيدة ، بينما تستهدف قطاعات 12/06 في جنين 1 2. تحت هذا الإعداد ، يمكن الكشف عن إشارة واضحة من قبل كل جبل الملاحظة 8 حقن آخر ساعة ، على الأقل في جزء واحد من جنين واحد من أصل عشرة. في ظل هذه الظروف ، وأكد كذلك أن وضع العلامات نسيلي (الشكل 1B ، C). عند استخدام الحمض النووي تركيزات عالية ، قد يحمل معظم الأجنة على الأقل حقنة واحدة ناجحة ، مما يثير احتمال أن يكون تم transfected خلايا متعددة.
وكشف التحليل التسلسلي المقطع الذي تم تحقيقه transfections نسيلي عندما كان معدل نجاح نحو 10 ٪. وهذا يعني أنه من أجل تحقيق قابلية التنسيل ، والأسلوب هو في التعريف ، وعدم كفاءة عالية. من ناحية أخرى ، في ظل هذه الظروف ، تم العثور على أكثر من 93 ٪ من الأحداث الإيجابية التي يمكن وسم 1 نسيلي.
الشكل 1. نسيلي حقن pCAGGS - GFP إلى الأسلاف العصبية والعظمية (AC) المقاطع العرضية تظهر توسيم الأنبوب العصبي الظهري (NT) (A) ، المجال بطناني من البضعة العضلية الجلدية (DM) (B) ، أو ورقة DM المركزية (C) ، 6hr بعد microinjection من pCAGGS - GFP إلى سلف واحد. (D) بعد يومين من ترنسفكأيشن نسيلي الأسلاف ، DM مركزية واحدة ولدت في كل من المشتقات الأدمة (D) وكذلك العضلات (M) (انظر المرجع 1 للحصول على التفاصيل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة أعلاه هو تعديل لأسلوب الموصوفة سابقا لتقديم الأصباغ محبة للدهون لمجموعات فرعية صغيرة أو خلية واحدة 3 الأسلاف. له ثلاث مزايا رئيسية على تقنية electroporation القياسية. أولا ، أنه يوفر وسيلة لوضع العلامات الثقة مع مواقع منفصلة في الأنسجة المستهدفة ، مما يسمح القرار المكانية أكبر بكثير من electroporation (انظر على سبيل المثال الشكل 1B ، C). الثانية ، ويسمح لخلايا وضع العلامات واحدة ، وبالتالي السماح لبنسبهم في الجسم الحي ، في ظل ظروف عادية على خلاف ذلك 1 2 (الشكل 1C ، D). الثالثة ، التعبير عن الجينات تفوت على مستوى وحيدة الخلية يوفر أداة للتحقيق في الآليات الجزيئية الفصل النسب ، لدراسة دور عوامل النمو أو من جينات أخرى على السلوك الخليوي في خلفية طبيعية على خلاف ذلك ، وما لذلك ، يكمل هذا الأسلوب تطبق هذه التقنية على نطاق واسع electroporation ، وكذلك يستغل سهولة الحصول على الجنين الطيور إلى المكانية ، زمنيا كسب ينظم وفقدان وظائف الجينات داخل الجسم الحي.
طلب متزايد الأهمية هو تحليل سلوكيات الخلوية على مستوى خلية واحدة (الهجرة الخلية ، والتوجيه محواري ، الانقسام الخلوي وغيرها) باستخدام تقنيات التصوير الناشئة يعيش 4 5 6 7. في بعض من هذه الإعدادات التجريبية ، فإنه قد يكون من المستحسن استخدام الأنواع مراسل التنشيط السريع (مثل الزهرة ، GFP) 8 ، وذلك للسماح سابق تصور الخلية المحقونة.
نظرا لبساطة الأسلوب الموصوفة هنا ، فمن المحتمل جدا أنه يمكن أيضا أن يكون تطبيقها على النماذج الحيوانية الأخرى مثل اسماك الزرد والقيطم. هذا النظام هو من السهل جدا لاقامة واستعمالها ، وتكمن الصعوبة الرئيسية في سلسلة كبيرة بما فيه الكفاية لتوليد الأجنة المسمى ، فضلا عن مسح لذرية المسمى في التطبيقات التي تتطلب التسلسلي المقاطع. في أيدينا ، وعرض خلايا حقن إشارة GFP اكتشافها بسهولة لمدة تصل إلى 3 أيام ، ولكن هذه المعلمة ومن المرجح أن تعتمد على معدلات انتشار الخلايا. به مراسل طويلة الأمد مثل لاك - Z ، أو ينقول بوساطة نقل الجينات التي تؤدي إلى التكامل مستقرة 9 ، قد يكون من الممكن اطالة البحث عن المفقودين في النسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر شلومي Krispin للصورة الأنبوب العصبي. على وجه الخصوص ، ونحن نعترف يوفال القرفة لبدء تقنية ترنسفكأيشن GFP. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل ، ورابطة مناهضة فرانسيز ليه الاعتلالات العضلية ، ودويتشه Forschungsgemeinshaft ، مركز البحوث التعاونية ل488 CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette tubes | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Insect needles | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
