Single Cell Transfectie in kippenembryo's

Summary

Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.

Abstract

Een centraal thema in de ontwikkelingsbiologie is de diversificatie van de geslachten en de opheldering van de onderliggende moleculaire mechanismen. Dit houdt een grondige analyse van het lot van afzonderlijke cellen in normale en experimentele omstandigheden. Te dien einde, transfectie methoden die enkele voorlopers doel zijn een eerste vereiste. We beschrijven hier een technisch eenvoudige methode voor het transfecteren enkele cellen in kip weefsels in-ovo, waardoor betrouwbare afstamming tracing en genetische manipulatie. Specifiek weefsel domeinen zijn gericht binnen de somiet of neurale buis, en DNA wordt rechtstreeks geïnjecteerd in het epitheel van belang, wat resulteert in sporadische transfectie van individuele cellen. Met behulp van verslaggevers, kan klonale populaties dus te herleiden tot drie dagen, en het gedrag van genetisch gemanipuleerde klonale populaties kunnen worden vergeleken met die van controles. Deze methode maakt gebruik van de toegankelijkheid van het kippenembryo samen met de nieuwe tools voor genetische manipulatie. We vergelijken en bespreken de voordelen ten opzichte van de veel gebruikte methode elektroporatie, en de mogelijke toepassingen en gebruik in de extra in-vivo modellen zijn ook gesuggereerd. Wij pleiten voor het gebruik van deze methode als een belangrijke aanvulling en een aanvulling voor de bestaande lineage tracing en genetische storing tools.

Protocol

1. Voorbereiding van de Micropipetten

Trekken we onze pipetten op een standaard Narishige pp-83 pipet trekker met een warmte instelling van 13,5. De precieze instelling moet worden gekalibreerd, gericht op een pipet tip diameter van tussen de 8 en 10 micron. We maken gebruik van filament-bevattende borosilicaat glazen buizen met een buitendiameter van 1,0 mm en een inwendige diameter van 0.75-0.78 mm. De pipetten zijn dus bewaard in een plastic schaaltje met de tips beschermd tegen contact met de randen van de schotel.

2. DNA Voorbereiding

Het plasmide van belang is getransfecteerd in DH5a E. coli met behulp van standaard procedures. 'S nachts culturen van enkele kolonies worden gebruikt om het plasmide met behulp van maxi-prep kits (een commerciële kit zou moeten doen) te zuiveren. We maken gebruik van een plasmide concentratie van 1,0 ng / ul voor niet-klonale injecties. Hogere concentraties toenemen verstopping van pipetpunten. Voor klonale toepassingen, plasmide-concentraties zijn veel lager en moeten worden aangepast (zie hieronder). Voor pCAGG-GFP, was de optimale concentratie de productie van klonale resultaten gevonden worden ongeveer 0,05-0,1 ug / ul. Een tot twee ul van plasmide wordt meestal gebruikt per experiment, en een minimale hoeveelheid fast-groen poeder (vast te houden aan het uiteinde van een droge, scherpe glazen pipet) wordt toegevoegd aan het plasmide voor het experiment begint. Het plasmide wordt dan gecentrifugeerd in een tabletop centrifuge gedurende 2 minuten bij maximale snelheid. Deze procedure lijkt te verminderen pipet-verstopping problemen.

3. Injectie van embryo's

3.1 Voorbereiding van embryo's

We maken gebruik van kwartel en kip eieren voor injecties. De eieren worden uitgebroed, liggend op hun lange as totdat de gewenste ontwikkelingsstadium. De eieren worden gereinigd met 70% ethanol en laten drogen. Het puntige uiteinde van het ei is doorboord met chirurgische schaar (dit is alleen nodig in kippeneieren) en 1 ml (in kwartels) of 2 ml (chick) van eiwit is afkomstig uit het ei met een 10 ml spuit (19G naald). De gaten worden dan afgesloten met warme paraffine.

Voorafgaand aan de eigenlijke injectie wordt een venster geopend op de top van de eischaal met behulp van chirurgische schaar. Het plaatsen van plakband over de shell en dwars door het kan bijdragen tot het verminderen puin van de shell. PBS buffer met antibiotica wordt onmiddellijk gepipetteerd in het ei. Om de toegang tot embryo, zijn de vitelline en / of vruchtwater membranen knippen en omgeleid met behulp van 0,14 mm insect pinnen gemonteerd op een naaldhouder. Niet-giftige inkt (Pelican # 17) wordt geïnjecteerd onder de blastoderm te helpen visualiseren het embryo, met behulp van een brand-getrokken capillaire gemonteerd op een afzuiger.

3.2 Laden en montage van micropipetten

De trekker micropipetten kan worden geladen met het plasmide door vuur-getrokken capillairen van voldoende diameter, gemonteerd op een afzuiger. Een minimale hoeveelheid van plasmide wordt getekend met behulp van de capillaire en geladen in de pipet uit de opening tegenover de geslepen punt, en het naderen van de tip van de binnenkant zo veel mogelijk. De pipet is dus geladen op een manuele luchtdruk injector gemonteerd op een micromanipulator. Minimale druk wordt toegepast, indien nodig, zodat het plasmide oplossing voor de tip van de pipet te bereiken.

3.3 Plasmide injectie

De pipet wordt gemanipuleerd in het vloeibare medium van het ei, terwijl het toepassen van wat lucht onder druk om te voorkomen dat verstopping van de pipetpunt. De relevante weefsel domein is doorboord. De verandering in druk als de punt het weefsel komt is vaak genoeg om plasmide los met zichtbare snel groen. Indien dit niet het geval is, van toepassing zijn lichte druk op de spuit totdat de plasmide / snel groen worden uitgeworpen. Dit proces kan worden herhaald langs de as van het embryo, bijvoorbeeld in aangrenzende somieten of langs de omvang van de neurale buis. Na de injecties, kan PBS worden toegevoegd. Het venster wordt gesloten met behulp van plakband (Parafilm is niet gewenst, met name voor de kwarteleitjes-het verhoogt embryo sterftecijfers, waarschijnlijk door het blokkeren van de uitwisseling van zuurstof door de shell). De behandelde embryo's worden teruggestuurd naar een incubator. Vermijd ventilatie en plaats kleine containers met water in de couveuse omdat ze bijdragen tot het behoud vocht en de opbrengst te verhogen.

4. Instellen Injectie Parameters en Monitoring Succespercentages

Asessing en kalibreren van de verschillende parameters injectie is van cruciaal belang voor toepassingen gericht op single-cell analyse. Niet elke injectie evenement zal leiden tot een succesvolle etikettering van een enkele cel. Plasmide concentratie die te hoog is kan leiden tot niet-klonale etikettering, terwijl de zeer lage concentraties leiden tot hoge uitval. De concentratie van de geïnjecteerde plasmide moet worden geoptimaliseerd voor klonale injecties. Wij raden verdunning van de gehele gezuiverde plasmide voorraad in plaats van te verdunnen individuele preps naar een vooraf bepaalde concentratie. Dit laatstekunnen introduceren enkele variantie van slagingspercentages, waarschijnlijk te wijten aan verschillen in zuiverheid en andere parameters, zoals het aandeel van de dubbele helix plasmide.

4.1 Het beoordelen slagingspercentages door ganse berg observatie

Eerste beoordeling van geïnjecteerde embryo's kunnen worden uitgevoerd door hele-mount observatie onder een tl-verrekijker. Zes tot acht uur na de injectie voldoende zijn om slagingspercentages te beoordelen met een pCAGG-enhanced GFP te construeren. Dit is op voorwaarde dat de beoogde locatie is oppervlakkig genoeg om te worden duidelijk zichtbaar (bijvoorbeeld de dorsale somiet, dorsale neurale buis, ectoderm etc, zie figuur 1A-C.). Deze stap is vooral nuttig voor het evalueren van experimentele serie exposeren of te veel gelabelde cellen of als alternatief, bij gebrek aan een fluorescerende cellen. Als verdere incubatie gewenst is, dient antibiotica-bevattende PBS-oplossing worden toegevoegd aan het ei en na het bekijken van de tape moet worden vervangen.

4.2 Het beoordelen klonaliteit door serial-sectie analyse

Het beste middel voor de beoordeling van de tarieven van de succesvolle injecties is door serieel-snijden geïnjecteerde embryo's en met behulp van immunohistochemie om de gelabelde cellen te visualiseren. Onder deze omstandigheden kan incubatietijd zo kort 4 uur na de injectie. De embryo's zijn vast en verwerkt voor paraffine snijden (of cryosectioning). Glas gemonteerde secties zijn vervolgens de-paraffinized en immuno-gekleurd voor reporter visualisatie. Amplificatiewerkwijzen zoals biotine-streptavidine wenselijk zou kunnen zijn. Ten slotte worden de seriële secties gescand naar gelabelde cellen te detecteren in geïnjecteerd segmenten. Indien bij de eerste proeven met meerdere in plaats van afzonderlijke cellen zijn verkregen, moet het plasmide voorraad verdund worden en het proces herhaald tot voldoende resultaten worden bereikt. Twee-tot 10-voudige verdunningen van het plasmide voorraad oplossing kan nodig zijn in gevallen van slaagpercentages te hoog.

Voor elk plasmide worden getransfecteerd, moet een grondige kalibratie die ervoor zorgt klonaliteit worden herhaald.

5. Representatieve resultaten

We meestal het uitvoeren van een enkele injectie van pCAGG-GFP per somiet, terwijl gericht op 6-12 segmenten per embryo ^{1 2.} Onder deze instelling kan een duidelijk signaal worden gedetecteerd door het ganse berg observatie 8 uur na injectie, in ten minste een segment van een embryo op de tien. Onder deze omstandigheden werd de etikettering verder bevestigd te worden klonale (Figuur 1B, C). Bij het gebruik van hoge concentraties DNA, kunnen de meeste embryo's vertonen ten minste een succesvolle injectie, waardoor de mogelijkheid dat er meerdere cellen zijn getransfecteerd.

Serial sectie analyse bleek dat klonale transfecties werden bereikt toen was het slagingspercentage ongeveer 10%. Dit betekent dat om te bereiken klonaliteit de techniek is per definitie zeer inefficiënt. Aan de andere kant, onder deze omstandigheden, werden meer dan 93% van de positieve etikettering evenementen gevonden te zijn klonale ^1.

Figuur 1. Klonale injecties van pCAGGS-GFP in de neurale en skelet voorvaderen. (AC) Dwars delen met de etikettering van de dorsale neurale buis (NT) (A), ventrolaterale domein van de dermomyotome (DM) (B), of centrale DM vel (C) , 6 uur na micro-injectie van pCAGGS-GFP aan een enkele progenitor. (D) Twee dagen na transfectie clonale van de centrale DM, enkele voorlopers gegenereerd derivaten, zowel in dermis (D) en spier (M) (zie ref. ¹ voor details).

Discussion

De hierboven beschreven methode is een wijziging van een eerder beschreven techniek voor het leveren van lipofiele kleurstoffen aan kleine cel subsets of enkele voorouders ^3. Het heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van de standaard electroporatie techniek. Ten eerste biedt het een middel voor het labelen met vertrouwen discrete sites in doelweefsels, wat een grotere ruimtelijke resolutie dan elektroporatie (zie bijvoorbeeld Figuur 1B, C). Ten tweede, het maakt het mogelijk de etikettering van enkele cellen, waardoor hun afkomst te traceren in-vivo onder overigens normale omstandigheden ^{een 2} (figuur 1C, D). Ten derde, gen miss-expressie in de single-cell niveau biedt een instrument voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van afkomst segregatie, voor het bestuderen van de rol van groeifactoren of van andere genen op cellulair gedrag in een overigens normale achtergrond, etc. Daarom is deze methode een aanvulling op het op grote schaal toegepast electroporatie techniek, en verder gebruik van de toegankelijkheid van de aviaire embryo te spatio-temporeel gereguleerd winst en verlies van gen-functie in-vivo.

Een steeds relevant toepassing is de analyse van de cellulaire gedrag op de enkele cel niveau (celmigratie, axonale begeleiding, de celdeling, etc.) met behulp van nieuwe live-imaging technologieën ^{4 5 6 7.} In sommige van deze experimentele instellingen, zou het wenselijk zijn om een snelle activering reporter soorten (zoals Venus-GFP) ^8, om te gebruiken om een eerdere visualisatie van de geïnjecteerde cel mogelijk te maken.

Gezien de eenvoud van de hier beschreven methode, is het zeer waarschijnlijk dat het ook kan worden toegepast op andere dieren modellen zoals zebravis en Xenopus. Het systeem is zeer eenvoudig te installeren en te gebruiken, en het grootste probleem is het genereren van voldoende grote serie van gelabelde embryo's, maar ook scannen voor het label nakomelingen in toepassingen die een serial-profielen. In onze handen, geïnjecteerde cellen vertoonden een gemakkelijk te detecteren GFP signaal voor tot 3 dagen, maar deze parameter is waarschijnlijk afhankelijk van de tarieven van de cel proliferatie. Met behulp van een langlevende reporter, zoals Lac-Z, of transposon-gemedieerde genoverdracht wat leidt tot stabiele integratie ^9, zou het mogelijk zijn om te verlengen tracering van de nakomelingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B