La transfection seule cellule dans des embryons de poulet

Summary

Utiliser pointe fine micropipettes nous injectons ADN plasmidique dans les sous-domaines de somites de poulet ou de tubes neuraux. La concentration du plasmide est ajustée pour produire seule des cellules transfectées. Nous avons ensuite permettre aux cellules de se développer en des populations clonales.

Abstract

Un thème central en biologie du développement est la diversification des lignées et l'élucidation des mécanismes sous-jacents moléculaire. Ceci implique une analyse approfondie des destins des cellules individuelles dans des conditions normales et expérimentales. À cette fin, les méthodes de transfection qui ciblent des progéniteurs simples sont une condition préalable. Nous décrivons ici une méthode techniquement simple pour la transfection des cellules individuelles dans les tissus de poulet in ovo, permettant la lignée fiables traçage ainsi que la manipulation génétique. Domaines spécifiques de tissus sont ciblés dans le somite ou du tube neural, et l'ADN est injecté directement dans l'épithélium de l'intérêt, résultant de la transfection de cellules sporadiques unique. L'utilisation des journalistes, des populations clonales peuvent par conséquent être tracée pour un maximum de trois jours, et le comportement des organismes génétiquement manipulés populations clonales peuvent être comparées à celles des contrôles. Cette méthode tire avantage de l'accessibilité de l'embryon de poulet ainsi que des outils émergents pour la manipulation génétique. Nous comparons et discutons de ses avantages sur la méthode d'électroporation largement utilisé, et les applications possibles et l'utilisation dans d'autres modèles in-vivo sont également suggérées. Nous préconisons l'utilisation de cette méthode comme un ajout important et se complètent pour la lignée actuelle des outils de traçage et d'interférence génétique.

Protocol

1. Préparation des micropipettes

Nous tirons nos pipettes sur une norme Narishige extracteur PP-83 pipettes avec un réglage de chaleur de 13,5. Le réglage précis doit être calibré, visant à une extrémité de la pipette de diamètre compris entre 8 et 10 microns. Nous utilisons des filaments des tubes contenant de verre borosilicate avec un diamètre extérieur de 1,0 mm et diamètre intérieur de 0,75 à 0,78 mm d'. Les pipettes sont donc stockés dans un récipient en plastique avec les bouts protégés de tout contact avec les bords du plat.

2. Préparation d'ADN

Le plasmide d'intérêt est transfectée dans DH5a E. coli en utilisant des procédures standard. Nuit à partir de cultures colonies isolées sont utilisées pour purifier le plasmide à l'aide maxi-prep kits (aucun kit commercial devrait faire). Nous utilisons une concentration plasmidique de 1,0 ug / uL pour les non-clonale injections. Des concentrations plus élevées augmentent le colmatage des embouts de pipette. Pour les applications clonale, les concentrations de plasmide sont beaucoup plus bas et doivent être ajustés (voir ci-dessous). Pour pCAGG-GFP, la concentration optimale des résultats clonale a été retrouvé à environ 0.05 à 0,1 pg / pl. Un à 2 pi de plasmide est généralement utilisé par expérience, et une quantité minime de fast-vert en poudre (adhérant à la pointe d'un sec, pipette en verre tranchants) est ajouté au plasmide avant le début de l'expérience. Le plasmide est ensuite centrifugé dans une centrifugeuse de paillasse pendant 2 minutes à vitesse maximale. Cette procédure semble réduire pipette problèmes de colmatage.

3. L'injection d'embryons

3.1 Préparation des embryons

Nous utilisons les cailles ainsi que des oeufs de poule pour les injections. Les œufs sont incubés mentir sur leur axe long jusqu'au stade désiré de développement. Les œufs sont tamponnées avec de l'éthanol 70% et on laisse sécher. L'extrémité pointue de l'œuf est percé de ciseaux chirurgicaux (ce qui n'est nécessaire que dans des oeufs de poule) et 1 ml (en cailles) ou 2 ml (poussins) de l'albumine est tiré de l'œuf avec une seringue de 10 ml (19G aiguille). Les trous sont ensuite scellés avec de la paraffine chaude.

Avant l'injection réelle, une fenêtre est ouverte dans le haut de la coquille d'oeuf à l'aide des ciseaux chirurgicaux. Placer du ruban adhésif sur la coque et la coupe à travers elle peut aider à réduire les débris de la coquille. Tampon PBS contenant des antibiotiques est pipeté immédiatement dans l'œuf. Pour accéder à l'embryon, la vitelline et / ou membranes amniotiques sont coupés et détourné en utilisant 0,14 mm broches insectes monté sur un porte-aiguille. Encre non toxique (Pélican # 17) est injecté sous le blastoderme pour aider à visualiser l'embryon, à l'aide d'un feu tiré par capillarité monté sur un aspirateur.

3.2 Chargement et montage de micropipettes

Les micropipettes extracteur peut être chargé avec le plasmide par le feu tirés par des capillaires de diamètre adéquat, monté sur un aspirateur. Une quantité minimale de plasmide est établi en utilisant les capillaires et chargé dans la pipette de son contraire l'ouverture à la pointe aiguisée, et, s'approchant de la pointe de l'intérieur autant que possible. La pipette est par conséquent chargé sur une pression d'air injecteur manuel monté sur un micromanipulateur. Pression minimale est appliquée, si nécessaire, afin de permettre à la solution plasmidique pour atteindre la pointe de la pipette.

3.3 injection de plasmides

La pipette est manipulé dans le milieu liquide de l'œuf tout en appliquant une certaine pression de l'air pour éviter le colmatage de l'extrémité de la pipette. Le domaine des tissus concernés est percée. Le changement de pression que la pointe pénètre dans le tissu est souvent suffisant pour libérer plasmide avec le vert rapide visible. Si ce n'est pas le cas, appliquez une légère pression à la seringue jusqu'à ce que le plasmide verte / rapides sont éjectés. Ce processus peut être répété sur l'axe de l'embryon, par exemple dans les somites adjacents ou le long de la mesure du tube neural. Après les injections, PBS peut être ajouté. La fenêtre est scellée à l'aide de ruban gommé (parafilm n'est pas souhaitable, surtout pour les oeufs de caille-il augmente le taux de mortalité embryonnaire, probablement en bloquant l'échange de l'oxygène à travers la coque). Les embryons traités sont retournés dans un incubateur. Éviter la ventilation et le lieu de petits contenants avec de l'eau dans l'incubateur, car ils aident à maintenir l'humidité et des rendements augmenter.

4. Réglage des paramètres d'injection et de surveillance Taux de réussite

Asessing et calibrer les paramètres d'injection différents est essentielle pour les applications visant à une seule cellule d'analyse. Pas tous les cas d'injection va conduire à l'étiquetage de succès d'une seule cellule. Concentration de plasmide qui est trop élevée peut conduire à la non-clonale étiquetage, tout en très faible concentration dans la suite des taux d'échec élevé. La concentration du plasmide injectée doit être optimisé pour des injections clonale. Nous vous recommandons de dilution de la totalité du stock plasmide purifié plutôt que de diluer preps individu à une concentration pré-déterminée. Ce dernierpourrait introduire une certaine variation des taux de réussite, probablement en raison de variations dans la pureté et d'autres paramètres tels que la proportion de plasmide superenroulé.

4.1 Évaluer les taux de réussite par le mont d'observation toute

L'évaluation initiale des embryons injectés peuvent être effectuées par l'ensemble de montage observation sous la loupe binoculaire fluorescentes. Six à huit heures après l'injection sont suffisantes pour évaluer les taux de réussite avec une construction GFP-pCAGG améliorée. Ceci est fourni sur le site cible est superficielle suffit pas d'être évidente (par exemple le somite dorsal, dorsale du tube neural, etc ectoderme, voir la figure 1A-C.). Cette étape est particulièrement utile pour évaluer les séries expérimentales montrant soit trop grand nombre de cellules marquées ou, alternativement, dépourvu de toute les cellules fluorescentes. Si l'incubation supplémentaire est souhaitée, les antibiotiques contenant une solution de PBS devrait être ajouté à l'œuf après le visionnement et la bande d'étanchéité doit être remplacée.

4.2 Évaluation par clonalité série-section de l'analyse

Le meilleur moyen pour évaluer le taux de succès des injections est de série de sectionnement embryons injectés et en utilisant l'immunohistochimie de visualiser les cellules marquées. Dans ces conditions, les temps d'incubation peut être aussi court que 4 heures après l'injection. Les embryons sont fixées et traitées pour la coupe de paraffine (ou cryosectioning). Verre-sections sont ensuite montées de-paraffinées et immuno-colorées pour la visualisation journaliste. Méthodes d'amplification telle que la biotine-streptavidine pourrait être souhaitable. Enfin, les sections de série sont scannés pour détecter les cellules marquées dans les segments injecté. Si, lors des premiers essais multiples plutôt que des cellules individuelles sont obtenus, le stock de plasmide doit être dilué et le processus répété jusqu'à ce que des résultats satisfaisants sont obtenus. Deux à 10 dilutions de la solution stock plasmide peut être nécessaire en cas de taux de réussite étant trop élevé.

Pour chaque plasmide à transfecter, une calibration complète qui assure la clonalité doit être répété.

5. Les résultats représentatifs

Nous généralement effectuer une seule injection de pCAGG-GFP par somite, tout en ciblant les segments 6-12 par embryon ^{1 2.} Sous ce réglage, un signal clair peuvent être détectées par l'observation monter toute injection 8 heures après, dans au moins un segment d'un embryon sur dix. Dans ces conditions, l'étiquetage a été confirmée à clonale (figure 1B, C). Lors de l'utilisation des concentrations d'ADN élevé, la plupart des embryons peuvent présenter au moins une injection réussie, soulevant la possibilité que plusieurs cellules ont été transfectées.

L'analyse a révélé que la section de série transfections clonale ont été atteints lorsque le taux de réussite était d'environ 10%. Cela signifie que pour atteindre clonalité, la technique est par définition, très inefficace. D'autre part, dans ces conditions, plus de 93% des événements ont été trouvés étiquetage positif à ^une clonale.

Figure 1. Clonale des injections pCAGGS-GFP en progéniteurs neuronaux et squelettiques. (AC) Les sections transversales montrant l'étiquetage du tube neural dorsal (NT) (A), le domaine de l'ventrolatérale dermomyotome (DM) (B), ou central feuille de DM (C) , 6 heures après la micro-injection d'pCAGGS-GFP à un ancêtre unique. (D) Deux jours après transfection clonale de la centrale SM, progéniteurs seule généré des dérivés dans les deux derme (D) ainsi que du muscle (M) (voir réf. ¹ pour les détails).

Discussion

La méthode décrite ci-dessus est une modification d'une technique décrite précédemment pour livrer les colorants lipophiles sous-ensembles à petites cellules ou des progéniteurs unique ^3. Il a trois avantages principaux sur la technique d'électroporation standard. Premièrement, elle fournit un moyen pour le marquage avec des sites de confiance discrète dans les tissus cibles, ce qui permet beaucoup plus grande résolution spatiale que l'électroporation (voir par exemple la figure 1B, C). Deuxièmement, elle permet l'étiquetage des cellules individuelles, permettant ainsi de retracer leur lignée in vivo dans des conditions normales contraire ^{1 2} (figure 1C, D). Troisièmement, le gène miss-expression au niveau unicellulaire fournit un outil pour étudier les mécanismes moléculaires de la ségrégation lignée, pour étudier le rôle des facteurs de croissance ou d'autres gènes sur le comportement cellulaire dans un milieu par ailleurs normal, etc Par conséquent, la méthode complète la technique d'électroporation largement appliquées, et d'autres exploits de l'accessibilité de l'embryon aviaire spatio-temporellement gagner réglementés et la perte de la fonction des gènes in vivo.

Une demande de plus en plus pertinente est l'analyse des comportements cellulaires à l'échelle de la cellule unique (la migration cellulaire, guidage axonal, la division cellulaire etc) en utilisant les technologies d'imagerie émergentes vivent ^{4 5 6 7.} Dans certains de ces paramètres expérimentaux, il pourrait être souhaitable d'utiliser une espèce journaliste rapide d'activation (comme Vénus-GFP) ⁸ afin de permettre une visualisation plus tôt de la cellule injectée.

Compte tenu de la simplicité de la méthode décrite ici, il est très probable que cela pourrait également être appliquée à d'autres modèles animaux tels que le poisson zèbre et xénope. Le système est très facile à configurer et à utiliser, et la principale difficulté est suffisamment grande générer des séries d'embryons étiquetés, ainsi que la numérisation pour les descendants étiqueté dans des applications nécessitant de série-sections. Dans nos mains, les cellules injectées présentaient un signal de la GFP facilement détectables jusqu'à 3 jours, mais ce paramètre est susceptible de dépendre sur le taux de prolifération cellulaire. L'utilisation d'un journaliste de longue durée telles que Lac-Z, ou de transfert de gène médié par transposon menant à l'intégration stable ^9, il pourrait être possible de prolonger le traçage de la descendance.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B