Summary
ठीक टिप का उपयोग micropipettes हम चिकन somites या तंत्रिका ट्यूब की उपडोमेन में प्लास्मिड डीएनए इंजेक्षन. प्लाज्मिड की एकाग्रता एकल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए समायोजित किया गया है. हम तो कोशिकाओं clonal आबादी में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
विकास जीव विज्ञान में एक केंद्रीय विषय प्रजातियों के विविधीकरण और अंतर्निहित आणविक तंत्र की व्याख्या है. यह सामान्य और प्रयोगात्मक शर्तों के तहत एकल कक्षों के भाग्य का एक गहन विश्लेषण की जरूरत पर जोर देता है. यह अंत करने के लिए, अभिकर्मक तरीकों कि एकल progenitors लक्ष्य एक शर्त रहे हैं. हम यहाँ ओवो में चिकन ऊतकों में एकल कक्षों transfecting अनुमति आनुवंशिक हेरफेर के रूप में विश्वसनीय के रूप में अच्छी तरह से अनुरेखण वंश के लिए एक तकनीकी रूप से सरल तरीका वर्णन. विशिष्ट ऊतकों डोमेन somite या तंत्रिका ट्यूब के भीतर लक्षित कर रहे हैं, और डीएनए सीधे ब्याज की उपकला में अंतःक्षिप्त है, एकल कक्षों की छिटपुट अभिकर्मक में जिसके परिणामस्वरूप. संवाददाताओं का प्रयोग, clonal आबादी फलस्वरूप लिए पता लगाया जा सकता है तीन दिन के लिए, और आनुवंशिक छेड़छाड़ clonal आबादी के व्यवहार नियंत्रणों के साथ तुलना की जा सकती है. इस विधि लड़की भ्रूण की पहुंच के आनुवंशिक हेरफेर के लिए उभरते उपकरणों के साथ साथ लाभ लेता है. हम तुलना और व्यापक रूप से इस्तेमाल electroporation पद्धति पर अपने फायदे है, और संभव अनुप्रयोगों पर चर्चा और अतिरिक्त में vivo मॉडल में भी सुझाव दिया उपयोग . हम एक महत्वपूर्ण इसके अलावा और मौजूदा वंश अनुरेखण और आनुवंशिक हस्तक्षेप उपकरण के लिए पूरक के रूप में इस विधि का उपयोग समर्थन करते हैं.
Protocol
1. Micropipettes की तैयारी
हम एक मानक Narishige पीपी 83 विंदुक डांड़ी पर 13.5 के एक गर्मी की स्थापना के साथ हमारे pipettes खींच. सटीक सेटिंग, कैलिब्रेटेड के बीच 8 और 10 microns के एक विंदुक टिप व्यास में लक्ष्य होना चाहिए. हम रेशा युक्त 1.0 मिमी और 0.75-0.78 मिमी भीतरी व्यास की एक बाहरी व्यास के साथ borosilicate ग्लास ट्यूब का उपयोग करें. pipettes फलस्वरूप पकवान की किनारों के साथ संपर्क से रक्षा की युक्तियों के साथ एक प्लास्टिक पकवान में संग्रहित कर रहे हैं.
2. डीएनए तैयार
ब्याज की प्लाज्मिड DH5α ई. में ट्रांसफ़ेक्ट है मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कोलाई. एकल कालोनियों से ओवरनाइट संस्कृतियों प्लाज्मिड का उपयोग मैक्सी प्रस्तुत करने किट (किसी भी व्यावसायिक किट करना चाहिए) शुद्ध किया जाता है. हम 1.0 का एक प्लाज्मिड एकाग्रता μg / गैर clonal इंजेक्शन के लिए μL का उपयोग करें. उच्च सांद्रता विंदुक युक्तियाँ के clogging वृद्धि हुई है. Clonal अनुप्रयोगों के लिए, प्लाज्मिड सांद्रता बहुत कम कर रहे हैं और (नीचे देखें) समायोजित किया जाना चाहिए. PCAGG - GFP के लिए, इष्टतम एकाग्रता clonal परिणाम के उत्पादन के बारे में μg / μL 0.05-0.1 होना पाया गया. प्लाज्मिड करने के लिए एक 2 μL आम तौर पर प्रयोग के प्रति इस्तेमाल किया है, और तेजी से हरे पाउडर की एक न्यूनतम राशि (एक सूखी, तेज ग्लास विंदुक के टिप का पालन) प्लाज्मिड जोड़ा जाता है पहले प्रयोग शुरू होता है. प्लाज्मिड तो अधिक से अधिक गति से 2 मिनट के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में centrifuged है. यह प्रक्रिया विंदुक-clogging समस्याओं को कम करने लगता है.
3. भ्रूण के इंजेक्शन
भ्रूण के 3.1 तैयारी
हम इंजेक्शन के लिए बटेर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चिकन अंडे का उपयोग करें. अंडे वांछित विकास मंच तक उनके लंबे अक्ष पर झूठ बोल incubated हैं. अंडे 70% इथेनॉल के साथ swabbed हैं और सूखे की अनुमति दी. अंडे के अंत बताया शल्य कैंची (इस चिकन अंडे में ही आवश्यक है) और 1 (बटेर में) एमएल या 2 अंडे की सफ़ेदी के एमएल (लड़की) है एक 10 एमएल सिरिंज (19G सुई) के साथ अंडे से तैयार के साथ छेदा है. छेद तो गर्म आयल के साथ बंद कर रहे हैं.
वास्तविक इंजेक्शन के लिए पहले, अंडा शल्य कैंची का उपयोग कर खोल के शीर्ष पर एक खिड़की खोली जाती है. खोल चिपचिपा टेप पर रखकर और यह माध्यम से काटने के खोल से मलबे को कम करने में मदद कर सकते हैं. पीबीएस एंटीबायोटिक दवाओं को युक्त बफर तुरंत अंडे में pipetted है. भ्रूण का उपयोग करने के लिए, vitelline और / या amniotic झिल्ली कट और 0.14 मिमी कीट एक सुई धारक पर घुड़सवार पिन का उपयोग बँट. गैर विषैले स्याही (Pelican # 17) भ्रूण कल्पना में मदद करने के लिए blastoderm के नीचे इंजेक्शन है, एक का उपयोग कर एक Aspirator पर घुड़सवार केशिका आग खींच लिया.
3.2 लोड हो रहा है और micropipettes के बढ़ते
डांड़ी micropipettes आग - खींच पर्याप्त व्यास के capillaries द्वारा प्लाज्मिड के साथ लोड किया जा सकता है, एक Aspirator पर घुड़सवार. प्लाज्मिड की एक न्यूनतम राशि अपने उद्घाटन विपरीत से तेज टिप के लिए विंदुक में केशिका और लोड का उपयोग कर, और जितना संभव के रूप में में अंदर से नोक आ तैयार की है. विंदुक फलस्वरूप एक मैनुअल हवा के दबाव सुई लगानेवाला एक micromanipulator पर घुड़सवार पर भरी हुई है. मिनिमल दबाव, यदि आवश्यक हो, क्रम में प्लाज्मिड समाधान विंदुक के टिप तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए लागू किया जाता है.
3.3 प्लाज्मिड इंजेक्शन
विंदुक अंडे के तरल माध्यम में हेरफेर है, जबकि कुछ हवा विंदुक टिप के clogging रोकने के लिए दबाव लागू. प्रासंगिक ऊतक डोमेन छेदा है. दबाव में परिवर्तन के रूप में टिप ऊतक में प्रवेश करती है अक्सर दिखाई तेजी से हरे रंग के साथ प्लाज्मिड रिहाई के लिए पर्याप्त है. यदि यह मामला नहीं है, सिरिंज थोड़ा दबाव लागू प्लाज्मिड / तेजी से हरे रंग जब तक निकली हैं. इस प्रक्रिया में भ्रूण के अक्ष के साथ दोहराया जा सकता है आसन्न somites में उदाहरण के लिए या न्यूरल ट्यूब की हद तक के साथ. इंजेक्शन के बाद, Pbs जोड़ा जा सकता है. खिड़की चिपचिपा टेप का उपयोग कर (parafilm बटेर के लिए विशेष रूप से वांछनीय नहीं है अंडे यह भ्रूण मृत्यु दर बढ़ जाती है, खोल के माध्यम से ऑक्सीजन का आदान - प्रदान को अवरुद्ध करके शायद) बंद है. इलाज भ्रूण को एक मशीन के लिए लौट रहे हैं. वेंटिलेशन से बचें और जगह इनक्यूबेटर में पानी के साथ छोटे कंटेनर के रूप में वे मदद नमी और पैदावार बढ़ाने में बनाए रखने के.
4. इंजेक्शन पैरामीटर समायोजित और सफलता दर की निगरानी
Asessing और विभिन्न इंजेक्शन मापदंडों औजार एकल कोशिका विश्लेषण में लक्ष्य अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. इंजेक्शन घटना नहीं हर किसी एकल कक्ष के सफल लेबलिंग का नेतृत्व करेंगे. प्लाज्मिड एकाग्रता जो बहुत अधिक है गैर - clonal लेबलिंग के लिए सीसा, जबकि उच्च विफलता दर में बहुत कम सांद्रता परिणाम कर सकते हैं. इंजेक्शन प्लाज्मिड की एकाग्रता clonal इंजेक्शन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. हम पूरे शुद्ध प्लाज्मिड शेयर के कमजोर पड़ने के बजाय अनुशंसा करते हैं एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता व्यक्ति preps गिराए से. बादसफलता दर, शायद शुद्धता और supercoiled प्लाज्मिड के अनुपात जैसे अन्य मानकों में बदलाव की वजह से कुछ विचरण शुरू हो सकता है.
4.1 पूरे माउंट अवलोकन द्वारा सफलता दर का आकलन
एक फ्लोरोसेंट द्विनेत्री के तहत पूरे माउंट अवलोकन द्वारा इंजेक्शन भ्रूण की प्रारंभिक मूल्यांकन किया जा सकता है. छह से आठ घंटे के बाद इंजेक्शन pCAGG बढ़ाया GFP के निर्माण के साथ सफलता दर का आकलन करने के लिए पर्याप्त हैं. यह लक्ष्य साइट काफी सतही आसानी से स्पष्ट हो (जैसे पृष्ठीय somite, पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब, बाह्य त्वक स्तर आदि, 1 ए सी चित्रा देखें.) है प्रदान की जाती है. यह कदम प्रयोगात्मक श्रृंखला या तो बहुत सारे लेबल कोशिकाओं या वैकल्पिक रूप से, किसी भी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की कमी प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. यदि आगे के ऊष्मायन वांछित है, एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पीबीएस समाधान को देखने के बाद अंडे जोड़ा जा चाहिए और सील टेप प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.
4.2 धारावाहिक अनुभाग विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन clonality
इंजेक्शन भ्रूण serially सेक्शनिंग और immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए लेबल कोशिकाओं कल्पना करके सफल इंजेक्शन की दरों का आकलन करने के लिए सबसे अच्छा साधन है. इन शर्तों के तहत, ऊष्मायन बार के रूप में 4 घंटे के बाद इंजेक्शन के रूप में कम किया जा सकता है. भ्रूण तय की और आयल सेक्शनिंग (या cryosectioning) के लिए संसाधित कर रहे हैं. घुड़सवार ग्लास वर्गों रहे हैं तो डे - paraffinized और संवाददाता दृश्य के लिए इम्युनो से सना हुआ. बायोटिन-streptavidin जैसे प्रवर्धन तरीकों वांछनीय हो सकता है. अंत में, धारावाहिक वर्गों इंजेक्शन क्षेत्रों में लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए स्कैन कर रहे हैं. यदि प्रारंभिक परीक्षणों पर एकल कक्षों के बजाय एकाधिक प्राप्त कर रहे हैं, प्लाज्मिड शेयर और पतला होना चाहिए है प्रक्रिया को दोहराया है जब तक पर्याप्त परिणाम प्राप्त कर रहे हैं. प्लाज्मिड शेयर समाधान के दो से 10 गुना dilutions सफलता बहुत अधिक किया जा रहा है दरों के मामलों में आवश्यक हो सकता है.
प्रत्येक प्लाज्मिड ट्रांसफ़ेक्ट किया जा करने के लिए, कि clonality सुनिश्चित करता है एक पूरी तरह से अंशांकन दोहराया जाना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
आम तौर पर हम बाहर somite प्रति pCAGG - GFP का एक इंजेक्शन ले, जबकि 1 2 भ्रूण प्रति 6-12 क्षेत्रों लक्ष्यीकरण. इस सेटिंग के तहत, एक स्पष्ट संकेत पूरे माउंट अवलोकन 8 घंटे के बाद इंजेक्शन द्वारा पता लगाया जा सकता है कम से कम दस में से एक बाहर भ्रूण के खंड में. इन शर्तों के तहत, लेबलिंग आगे clonal (चित्रा 1 बी, सी) के लिए पुष्टि की गई. है जब उच्च डीएनए सांद्रता का उपयोग कर, अधिकांश भ्रूण कम से कम एक सफल इंजेक्शन प्रदर्शन संभावना है कि एकाधिक कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है की स्थापना कर सकते हैं.
सीरियल अनुभाग विश्लेषण से पता चला है कि clonal transfections प्राप्त थे जब सफलता की दर के बारे में 10% था. इसका मतलब यह है कि क्रम में clonality प्राप्त करने के लिए, तकनीक परिभाषा के अनुसार, अत्यधिक अक्षम. दूसरी ओर, इन शर्तों के तहत, सकारात्मक लेबलिंग घटनाओं के 93% से अधिक 1 clonal पाए गए.
चित्रा 1. तंत्रिका और कंकाल progenitors में pCAGGS GFP की clonal इंजेक्शन (एसी) ट्रांसवर्स वर्गों पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब की लेबलिंग (NT) (ए), dermomyotome (डीएम) (बी) के ventrolateral डोमेन, या केंद्रीय डीएम शीट (सी) दिखा. , pCAGGS - GFP के microinjection के बाद एक एकल पूर्वज 6hr. (डी) केंद्रीय डीएम, एकल दोनों dermis (डी) के रूप में अच्छी तरह के रूप में मांसपेशियों (एम) (रेफरी देखने के विवरण के लिए 1.) में डेरिवेटिव उत्पन्न progenitors की clonal अभिकर्मक के बाद दो दिन.
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Discussion
ऊपर वर्णित विधि छोटे सेल सबसेट या एक 3 progenitors lipophilic रंजक देने के लिए एक पहले से वर्णित तकनीक के एक संशोधन है. यह मानक electroporation तकनीक पर तीन मुख्य लाभ है. सबसे पहले, यह लक्ष्य ऊतकों में विश्वास असतत साइटों के साथ लेबलिंग के लिए एक साधन प्रदान करता है, electroporation की तुलना में बहुत अधिक स्थानिक संकल्प (उदाहरण के चित्रा 1 बी को देखने के लिए, सी) की अनुमति. दूसरा, यह एकल कक्षों की लेबलिंग परमिट, इस प्रकार vivo में अन्यथा सामान्य 2 1 (चित्रा 1C, डी) शर्तों के तहत उनके वंश का पता लगाने की अनुमति है. तीसरा, एकल कोशिका स्तर पर याद अभिव्यक्ति जीन के वंश, अलगाव, एक अन्यथा सामान्य पृष्ठभूमि में वृद्धि कारकों या सेलुलर व्यवहार पर अन्य जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए आणविक तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण प्रदान करता है, आदि इसलिए, इस विधि पूरक व्यापक रूप से लागू electroporation, तकनीक, और आगे spatio-अस्थायी विनियमित लाभ और जीन समारोह में vivo के नुकसान के लिए एवियन भ्रूण की पहुंच का लाभ उठाते.
एक तेजी से प्रासंगिक आवेदन उभरते रहते इमेजिंग 4 5 6 7 प्रौद्योगिकियों का उपयोग एकल कोशिका (सेल प्रवास, axonal मार्गदर्शन, कोशिका विभाजन आदि) स्तर पर सेलुलर व्यवहार का विश्लेषण है. इन प्रयोगात्मक सेटिंग्स के कुछ में, यह एक तेजी से सक्रियण रिपोर्टर की प्रजातियों (जैसे वीनस - GFP के रूप में) 8 क्रम में उपयोग करने के लिए इंजेक्शन कक्ष के पहले के एक दृश्य की अनुमति वांछनीय हो सकता है.
यहाँ वर्णित विधि की सादगी को देखते हुए, यह बहुत संभावना है कि यह भी Zebrafish और Xenopus जैसे अन्य पशु मॉडल को लागू किया जा सकता है. सिस्टम सेट अप और उपयोग बहुत आसान है, और मुख्य कठिनाई लेबल भ्रूण की पर्याप्त बड़ी श्रृंखला पैदा कर रहा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से धारावाहिक वर्गों की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों में लेबल संतान के लिए स्कैनिंग. हमारे हाथ में, कोशिकाओं को इंजेक्शन के 3 दिनों के लिए एक आसानी से detectable संकेत GFP का प्रदर्शन है, लेकिन इस पैरामीटर के लिए सेल प्रसार की दर पर निर्भर होने की संभावना है. Lac-Z के रूप में लंबे समय से रहते थे, एक पत्रकार या transposon की मध्यस्थता जीन स्थिर 9 एकीकरण के लिए अग्रणी हस्तांतरण का उपयोग कर, यह संभव हो सकता है के लिए संतान की अनुरेखण लम्बा हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम न्यूरल ट्यूब छवि के लिए Shlomi Krispin धन्यवाद. विशेष रूप में, हम GFP अभिकर्मक तकनीक की शुरुआत के लिए Yuval दालचीनी स्वीकार करते हैं. इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन, एसोसिएशन Francaise contre les myopathies, और ड्यूश Forschungsgemeinshaft, सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 488 से सी.के. अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette tubes | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Insect needles | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
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