鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

Summary

ファインチップを使用すると、我々はニワトリの体節や神経管のサブドメインにプラスミドDNAを注入するマイクロピペット。プラスミドの濃度は、単一のトランスフェクションされた細胞を生成するために調整されます。私たちは、その後、細胞はクローン集団に発展することができます。

Abstract

発生生物学の中心テーマは、系統の多様化と分子メカニズムの解明である。これは正常な実験条件下で単一細胞の運命の徹底的な分析を伴います。この目的のために、単一の前駆細胞を標的とトランスフェクション法が前提です。私たちはトレーシング信頼性の高い系統と同様に遺伝子操作を可能にする、ここに、OVOでの鶏の組織で単一の細胞をトランスフェクトするための技術的に簡単な方法を説明します。特定の組織のドメインは、体節や神経管の中でターゲットとしている、とするDNAを単一の細胞の散発的なトランスフェクションの結果、関心の上皮に直接注入される。記者を使って、クローン集団は結果的に3日間まで遡ることができる、そして遺伝子操作クローン集団の挙動は、対照のそれと比較することができます。このメソッドは、遺伝子操作のための新たなツールと共に、ニワトリ胚のアクセシビリティを活用しています。我々は、比較とその広く使用されているエレクトロポレーション法上の利点、および可能なアプリケーションについて説明し、また提案されている追加のin vivoモデルで使用してください。我々は既存の系統のトレースと遺伝的干渉のツールのための重要な追加機能と補完するものとしてこのメ​​ソッドの使用を提唱。

Protocol

1。マイクロピペットの準備

我々は13.5の熱が設定された標準ナリシゲPP - 83ピペットプラーで私たちのピペットを引く。正確な設定は8〜10ミクロンのピペットの先端径を目指して、校正する必要があります。私たちは、フィラメントを含有する1.0ミリメートルと0.75〜0.78ミリメートルの内径、外径とホウケイ酸ガラス管を使用してください。ピペットは、結果的に皿の縁との接触から保護されたヒントとプラスチック製の皿に格納されています。

2。 DNAの調製

目的のプラスミドを大腸菌 DH5αにトランスフェクトさ標準的な手順を用いて大腸菌 。単一のコロニーから一晩培養し、プラスミドを使用してマキシプレップキットを（任意の市販のキットが何をすべき）を精製するために使用されます。我々は、非クローン性注射用は1.0μg/μLのプラスミド濃度を使用してください。高濃度では、ピペットチップの目詰まりを増加させる。クローンのアプリケーションでは、プラスミドの濃度ははるかに低いですし（下記参照）を調整する必要があります。 pCAGG - GFPの場合は、クローンの結果を生成する最適な濃度は約0.05から0.1μg/μLのであることが判明した。プラスミドの1〜2μLは、通常、実験ごとに使用され、実験が始まる前に高速緑色の粉末（乾燥、鋭いガラスピペットの先端に付着している）は必要最小限のプラスミドに追加されます。プラスミドは、最大速度で2分間、卓上遠心機で遠心分離される。この手順では、ピペット、目詰まりの問題を軽減するようです。

3。胚の注入

胚3.1準備

私たちは、注射用ウズラと同様に鶏の卵を使用してください。卵は、所望の発達段階まで、その長軸上に寝そべってインキュベートする。卵は70％エタノールでswabbedと乾燥させる。卵の先端は、外科用はさみ（これが唯一の鶏の卵に必要である）と1mLの（ウズラ）または10 mLシリンジ（19G針）で卵から描かれている卵白を2mL（ひよこ）で穴を開けている。セキュリティホールは、熱いパラフィンで密封されています。

実際の注入に先立ち、ウィンドウは、外科はさみを使って卵の殻の上部に開かれます。シェルを介して粘着テープを置いて、それを切断するには、シェルから破片を減らすことができます。抗生物質を含むPBS緩衝液を卵にすぐにピペットで入れる。胚にアクセスするには、卵黄及び/または羊膜は、ニードルホルダーにマウントさ0.14ミリメートル虫ピンを使ってカットして迂回されます。非毒性インク（ペリカン＃17）アスピレーターに搭載されたキャピラリープル火を使用して、胚を視覚化するために胚盤葉の下に注入されます。

3.2マイクロピペットのロードとマウント

引き手のマイクロピペットをアスピレーターにマウントされている、適切な直径の火 - プ​​ル毛細血管によってプラスミドをロードすることができます。プラスミドは必要最小限のキャピラリーを使用して、その開口部の反対側から先鋭化先端にピペットにロードされ、そして可能な限り内側から先端に近づいて描画されます。ピペットは、結果的にインジェクターがマニピュレータに搭載された手動の空気の圧力の上にロードされます。最小限の圧力は、プラスミド溶液は、ピペットの先端に到達することを可能にするために、必要に応じて、適用されます。

3.3プラスミド注入

ピペットチップの目詰まりを防ぐためにいくつかの空気の圧力をかけながらピペットを卵の液体培地中に操作されます。関連する組織のドメインを刺している。先端が組織に入ると圧力の変化が頻繁に目に見える速いグリーンでプラスミド放出するのに十分です。そうでない場合は、プラスミド/高速グリーンになるまで注射器にわずかな圧力を適用して排出されます。このプロセスは、隣接する体節の例のためにまたは神経管の範囲に沿って、胚の軸に沿って繰り返すことができます。注射後、PBSを添加してもよい。ウィンドウが（パラフィルムは、特にウズラのために望ましいものではない卵、これはシェルを介して酸素交換を遮断することによって、おそらく、胚の死亡率を増加させる）粘着テープを用いて封止されている。処理された胚をインキュベーターに戻されます。換気を避け、彼らが水分と増加収量を維持するためにインキュベーターの水で小さな容器を置きます。

4。注入パラメータを調整し、成功率を監視

Asessingと様々な注入パラメータのキャリブレーションは、シングルセル解析を目指したアプリケーションにとって重要です。いないすべての注入イベントは、単一セルの成功ラベリングにつながる。高い故障率の非常に低濃度の結果ながら、高すぎるとプラスミド濃度は、非クローン性ラベリングにつながることができます。注入されたプラスミドの濃度は、クローンの注射のために最適化されている必要があります。我々は、あらかじめ決められた濃度に個々のプレップを希釈するのではなく、全体の精製されたプラスミド株式の希薄化をお勧めします。後者のおそらく、そのようなスーパーコイルプラスミドの割合として純度の変動と他のパラメータの設定によって、成功率のいくつかの差異が導入される可能性があります。

全体のマウントの観察によって成功率の評価4.1

注入された胚の初期評価は、蛍光双眼でホールマウントの観察によって行うことができます。 6〜8時間後に注射はpCAGG強化されたGFPのコンストラクトで成功率を評価するために十分である。これは、標的部位（例えば背側体節、背側神経管、外胚葉などは、図1A - Cを参照してください。）容易に明らかになるのに十分な表面的な状態で提供される。このステップでは、あまりにも多くの標識細胞あるいは、任意の蛍光細胞が欠如しているのどちらかを示す実験的なシリーズを評価するために特に有用です。さらにインキュベーションを希望する場合は、抗生物質含有PBS溶液を表示した後に卵を追加する必要がありますし、シールテープを交換する必要があります。

シリアルセクション分析によってクローンの評価4.2

成功した注射の速度を評価するための最良の手段は、注入された胚を直列に切片と標識された細胞を可視化するために免疫組織化学を使用することです。これらの条件下では、インキュベーション時間は4時間後の注射可能な限り短くすることができます。胚を固定し、パラフィン切片（またはcryosectioning）のために処理されます。ガラスにマウントされたセクションは、脱パラフィン処理し、レポーターの可視化のための免疫染色です。このようなビオチン - ストレプトアビジンのような増幅方法は、望ましいかもしれません。最後に、連続切片を注入セグメントで標識された細胞を検出するためにスキャンされます。むしろ、単一細胞よりも複数の時に最初の試験が得られる場合、十分な結果が得られるまで、プラスミド株式を希釈し、プロセスが繰り返されている必要があります。プラスミドストック溶液の2〜10倍希釈では高すぎて成功率のケースで必要になる場合があります。

それぞれのプラスミドをトランスフェクトされるため、クローンを確実に徹底したキャリブレーションを繰り返す必要があります。

5。代表的な結果

胚^{1 2}あたり6〜12のセグメントをターゲットにしながら我々は一般的に、体節ごとpCAGG - GFPの単回注射を行う。この設定では、明確なシグナルは10のうち1胚の少なくとも1つのセグメントでは、全体のマウントの観察8時間のポスト噴射により検出することができます。これらの条件下で、標識は、さらに（図1B、C）クローンであることが確認された。高DNA濃度を使用する場合、ほとんどの胚は、複数のセルをトランスフェクトされたという可能性を高め、少なくとも一つの成功注入を示すことができる。

連続切片の解析では、成功率は約10％のときクローンのトランスフェクションが達成されたことを明らかにした。これは、クローンを達成するために、技術は、定義ごとに非常に非効率的であることを意味します。一方、これらの条件下で、正のラベリングイベントの93％以上は¹クローンであることがわかった。

図1。神経や骨格前駆細胞にpCAGGS - GFPのクローン注射。背側神経管のラベル（NT）（A）、dermomyotome（DM）（B）の腹ドメイン、または中央のDMシート（C）を示す（AC）横断切片では、 、単一の前駆細胞にpCAGGS - GFPのマイクロインジェクション後6hr。 （D）真皮（D）だけでなく、筋肉（M）（refを参照してください。詳細については^、1）両方の誘導体を生成された中央のDM、単一の前駆細胞のクローン性のトランスフェクション後二日。

Discussion

上記の方法では、小細胞サブセットまたは単一の前駆細胞を³に親油性色素を提供するための前述した手法を変更したものです。それは標準的なエレクトロポレーション法に比べて3つの主な利点があります。最初に、それは（C、例えば図1Bを参照されたい）、エレクトロポレーションよりはるかに大きい空間分解能を可能にする、標的組織への信頼離散サイトで標識するための手段を提供します。第二に、それはこのようにそれ以外の場合は、通常の条件下で^{1 2（}図1C、D）を、in vivoでその系譜をトレースできるように、単一細胞の標識が許可されます。第三に、単一細胞レベルで遺伝子ミス発現は、その成長因子のまたはそれ以外の場合は、通常バックグラウンドでの細胞挙動に関する他の遺伝子の役割を研究するための系統分離の分子機構、などを調査するためのツールを提供する、この方法では、補完広くエレクトロポレーション技術を適用し、さらに、in vivoでの遺伝子機能の空間時間的調節のゲインおよびロスに鳥類胚のアクセシビリティを利用している。

ますます、関連するアプリケーションは、新興のライブイメージング技術^{4 5 6 7を}使用して単一細胞レベル（細胞移動、軸索誘導、細胞分裂など）での携帯電話の動作の分析です。これらの実験の設定の一部では、それは注入されたセルの以前の可視化を可能にする迅速な活性化レポーターの種（例えば、金星- GFPなど）の順序で^8を使用することが望ましい場合があります。

ここで説明する方法のシンプルさを考えると、それはまた、ゼブラフィッシュやアフリカツメガエルなどの他の動物モデルに適用できる可能性が非常に高いです。システムがセットアップして使用することは非常に容易である、と主な難しさは、標識された胚の十分な大きさのシリーズを生成するだけでなく、シリアルのセクションを必要とするアプリケーションで標識された子孫のためにスキャンしています。私たちの手では、注入された細胞は、最大3日まで​​のための容易に検出可能なGFPのシグナルを示したが、このパラメータは、細胞増殖の速度に依存する可能性があります。このようなラック- Zのような長寿命のレポーター、または安定した統合⁹につながるトランスポゾンによる遺伝子導入を使用して、それは子孫のトレースを延長することができる可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B