Transfecção única célula em embriões de galinha

Summary

Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.

Abstract

Um tema central em biologia do desenvolvimento é a diversificação de linhagens ea elucidação dos mecanismos subjacentes molecular. Isto implica uma análise profunda dos destinos de uma única célula em condições normais e experimentais. Para este fim, métodos de transfecção que visam única progenitores são um pré-requisito. Descrevemos aqui um método tecnicamente simples para transfecting células individuais em tecidos de frango in-ovo, permitindo que a linhagem confiável de rastreamento, bem como a manipulação genética. Domínios tecidos específicos são direcionados dentro do somito ou tubo neural, e DNA é injetado diretamente no epitélio de interesse, resultando em transfecção de células individuais esporádicos. Usando repórteres, populações clonais pode conseqüentemente ser seguido por até três dias, e comportamento de populações geneticamente manipulados clonal pode ser comparada com a de controles. Este método aproveita a acessibilidade do embrião de galinha juntamente com ferramentas emergentes para a manipulação genética. Nós comparar e discutir suas vantagens sobre o método de eletroporação amplamente utilizado, e possíveis aplicações e uso em mais in-vivo modelos são também sugeridas. Defendemos o uso deste método como um acréscimo significativo e complementar para os actuais linhagem rastreamento e ferramentas de interferência genética.

Protocol

1. Preparação de Micropipetas

Puxamos nossas pipetas em um padrão Narishige pp-83 pipeta extrator com uma configuração de calor de 13,5. A definição precisa deve ser calibrado, visando um diâmetro ponta da pipeta de 8 a 10 microns. Usamos filamento contendo tubos de vidro de borosilicato com um diâmetro exterior de 1,0 mm e diâmetro interno de 0,75-0,78 mm. As pipetas são, consequentemente, armazenados em um prato de plástico com as pontas protegidas do contato com as bordas do prato.

2. Preparação DNA

O plasmídeo de interesse é transfectado em DH5α E. coli usando os procedimentos padrão. Culturas durante a noite de colônias isoladas são usadas para purificar o plasmídeo usando maxi-prep kits (qualquer kit comercial deve fazer). Usamos uma concentração plasmídeo de 1,0 mg / mL para não-clonal injeções. Concentrações mais altas aumentam o entupimento das pontas de pipeta. Para aplicações clonal, as concentrações de plasmídeo são muito menores e deve ser ajustada (ver abaixo). Para pCAGG-GFP, a concentração ideal produzindo resultados clonal foi encontrado em cerca de 0,05-0,1 mg / mL. Um a 2 mL de plasmídeo é tipicamente usado por experiência, e uma quantidade mínima de fast-verde em pó (aderindo à ponta de uma pipeta de vidro seco, sharp) é adicionado ao plasmídeo antes do experimento começa. O plasmídeo é então centrifugado em uma centrífuga de mesa por 2 minutos em velocidade máxima. Este procedimento parece reduzir pipeta-entupimento problemas.

3. Injeção de Embriões

3.1 Preparação de embriões

Usamos codornas, assim como os ovos de galinha para injectáveis. Os ovos são incubados deitado no seu longo eixo até o estágio de desenvolvimento desejado. Os ovos são limpo com álcool 70% e deixa-se secar. A ponta do ovo é perfurado com uma tesoura cirúrgica (isto é necessário apenas em ovos de galinha) e 1 mL (em codornas) ou 2 mL (bico) de albumina é traçada a partir do ovo com uma seringa de 10 mL (19G agulha). Os buracos são seladas com parafina quente.

Antes da injeção real, uma janela é aberta no topo da casca do ovo com uma tesoura cirúrgica. Colocação de fita adesiva sobre a casca e cortando-lo pode ajudar a reduzir os detritos da shell. Tampão PBS contendo antibióticos é pipetado imediatamente para o ovo. Para acessar o embrião, o vitelínico e / ou membranas amnióticas são cortadas e desviada usando pinos 0,14 milímetros de insetos montados em um suporte de agulha. Tinta não tóxica (Pelican # 17) é injetado debaixo da blastoderma para ajudar a visualizar o embrião, usando um fogo puxado capilar montado em um aspirador.

Carregando 3,2 e montagem de micropipetas

O micropipetas extrator pode ser carregado com o plasmídeo pelo fogo puxado capilares de diâmetro adequado, montados em um aspirador. A quantidade mínima de plasmídeo é desenhado com o capilar e carregado na pipeta seu oposto abertura para a ponta afiada, e se aproximando da ponta do lado de dentro, tanto quanto possível. A pipeta é, consequentemente, carregado em uma pressão de ar manual injector montado em um micromanipulador. Pressão mínima é aplicado, se necessário, de modo a permitir a solução de plasmídeo para alcançar a ponta da pipeta.

3,3 injeção Plasmid

A pipeta é manipulado no meio líquido do ovo ao aplicar alguma pressão de ar para evitar o entupimento da ponta da pipeta. O domínio do tecido relevante é perfurada. A mudança na pressão como a ponta entra no tecido é muitas vezes suficiente para liberar plasmídeo com verde rápido visível. Se este não for o caso, aplique uma leve pressão na seringa até que o verde plasmídeo / fast são ejetados. Este processo pode ser repetido ao longo do eixo do embrião, por exemplo, em somitos adjacentes ou ao longo da extensão do tubo neural. Após as injeções, PBS podem ser adicionados. A janela é selada com fita adesiva (parafilme não é desejável especialmente para ovos de codorna, ela aumenta as taxas de mortalidade embrionária, provavelmente através do bloqueio troca de oxigênio através do shell). Os embriões tratados são retornados para uma incubadora. Evitar a ventilação e coloque pequenos recipientes com água na incubadora como eles ajudam a manter rendimentos e aumentar a umidade.

4. Ajustar os parâmetros de injeção e Monitoramento Taxas de Sucesso

Asessing e calibrar vários parâmetros de injeção é crítica para aplicações que visam a análise de uma única célula. Não um evento cada injecção levará a rotulagem de sucesso de uma única célula. Plasmídeo de concentração que é muito alto pode levar a não-clonal rotulagem, enquanto concentrações muito baixas resultam em elevadas taxas de insucesso. A concentração do plasmídeo injetada deve ser otimizado para injeções clonal. Recomendamos diluição de todo o estoque purificada plasmídeo, em vez de diluir preps indivíduo a uma concentração pré-determinada. O últimopoderia introduzir alguma variação de taxas de sucesso, provavelmente devido a variações na pureza e outros parâmetros como a proporção de plasmídeo superenrolado.

4,1 Avaliando as taxas de sucesso pela observação montar toda

Avaliação inicial de embriões injetados podem ser realizadas por todo o monte de observação com um binóculo fluorescente. De seis a oito horas após a injecção são suficientes para avaliar as taxas de sucesso com uma construção GFP pCAGG avançada. Isto é, desde que o site de destino é superficial o bastante para ser prontamente aparente (por exemplo, o somito dorsal, tubo neural dorsal, etc ectoderma, veja a Figura 1A-C).. Esta etapa é particularmente útil para avaliar a série experimental exibindo ou muitas células marcadas ou, alternativamente, na falta de quaisquer células fluorescentes. Se mais de incubação é desejado, os antibióticos contendo solução de PBS devem ser adicionados ao ovo e depois de ver a fita de vedação deve ser substituído.

Avaliando 4,2 clonalidade pelo serial-seção de análise

O melhor meio para avaliar as taxas de injeções de sucesso é de série-secção embriões injetado e utilizando imuno-histoquímica para visualizar as células marcadas. Sob essas condições, os tempos de incubação pode ser tão curto como 4 horas após a injecção. Os embriões são fixadas e processadas para o seccionamento de parafina (ou cryosectioning). De vidro montada em secções são então de-paraffinized e imuno-coloração para visualização repórter. Métodos de amplificação, como biotina-estreptavidina pode ser desejável. Finalmente, as seções de série são verificados para detectar células marcadas nos segmentos injetados. Se, após testes iniciais múltiplas em vez de células individuais são obtidas, o estoque plasmídeo deve ser diluído eo processo é repetido até que os resultados adequados sejam atingidos. Duas a 10 vezes diluições da solução-mãe plasmídeo pode ser necessária em casos de taxas de sucesso serem muito altas.

Para cada plasmídeo a ser transfectadas, uma calibração minuciosa que garante a clonalidade deve ser repetido.

5. Resultados representante

Normalmente, realizar uma única injeção de pCAGG-GFP por somito, ao passo que a focalização nos segmentos 12/06 por embrião ^{1 2.} Sob essa configuração, um claro sinal pode ser detectado por toda observação pós-injeção de montagem de 8 horas, em pelo menos um segmento de um embrião em cada dez. Sob essas condições, rotulagem foi confirmada para ser clonal (Figura 1B, C). Quando se utiliza concentrações elevadas de DNA, a maioria dos embriões podem apresentar pelo menos uma injeção de sucesso, levantando a possibilidade de que várias células foram transfectadas.

Análise da seção de série revelou que transfections clonal foram alcançados quando a taxa de sucesso foi de cerca de 10%. Isto significa que para atingir clonalidade, a técnica é, por definição, altamente ineficiente. Por outro lado, nessas condições, mais de 93% dos eventos de rotulagem positiva foram encontrados para ser ^um clonal.

Figura 1. Injeções clonal de pCAGGS-GFP em progenitores neurais e esquelético. (AC) seções transversais mostrando rotulagem do tubo neural dorsal (NT) (A), de domínio ventrolateral do dermomyotome (DM) (B), ou folha de DM central (C) , 6h após a microinjeção de pCAGGS-GFP a um único progenitor. (D) Dois dias após a transfecção clonal da central DM, progenitores único gerado derivados em ambos os derme (D), bem como músculo (M) (ver ref. ¹ para detalhes).

Discussion

O método descrito acima é uma modificação de uma técnica descrita anteriormente para a entrega de corantes lipofílicos para subpopulações de células pequenas ou progenitores única ^3. Ele tem três grandes vantagens sobre a técnica de eletroporação padrão. Primeiro, ele fornece um meio para a rotulagem com sites de confiança discretas em tecidos-alvo, permitindo maior resolução espacial do que eletroporação (ver, por exemplo, Figura 1B, C). Segundo, que permite a rotulagem de uma única célula, permitindo assim traçar sua linhagem in-vivo sob condições normais de outra forma ^{1 2} (Figura 1C, D). Terceiro, falta gene-expressão ao nível de uma única célula fornece uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares da segregação linhagem, para estudar o papel dos fatores de crescimento ou de outros genes no comportamento celular em um fundo de outra forma normal, etc Portanto, este método complementa a técnica da eletroporação amplamente aplicado, e ainda explora a acessibilidade do embrião aviária para espaciotemporalmente ganho de regulados e perda da função dos genes in vivo.

Uma aplicação cada vez mais relevante é a análise de comportamentos de celulares no nível da célula única (migração celular, a orientação axonal, a divisão celular, etc) usando emergentes tecnologias de imagem ao vivo ^{4 5 6 7.} Em algumas dessas configurações experimentais, pode ser desejável usar uma espécie de rápido activação repórter (como Vênus-GFP) ^8, a fim de permitir uma visualização antes da célula injetada.

Dada a simplicidade do método aqui descrito, é muito provável que ele também poderia ser aplicado a outros modelos animais, como Zebrafish e Xenopus. O sistema é muito fácil de configurar e usar, e a principal dificuldade está gerando série suficientemente grande de embriões rotulados, bem como a verificação de progênie rotulados em aplicações que requerem serial-seções. Em nossas mãos, as células injetadas exibiu um sinal GFP facilmente detectável por até 3 dias, mas este parâmetro é provável que dependem das taxas de proliferação celular. Usando uma repórter de longa duração, como Lac-Z, ou transposon mediada por transferência de genes levando a integração estável ^9, pode ser possível para prolongar o rastreio da progênie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B