Summary
Использование тонких кончика микропипетки мы вводим плазмиды ДНК в подобластях куриного сомитов или нервных трубок. Концентрация плазмиды регулируется для получения одного трансфекции клеток. Затем мы позволить клеткам развиваться в клональных популяций.
Abstract
Центральной темой в биологии развития, является диверсификация линий и выяснение основных молекулярных механизмов. Это влечет за собой тщательный анализ судьбы отдельных клеток в норме и при экспериментальных условиях. С этой целью трансфекции методы, ориентированные одного прародителями являются необходимым условием. Мы описываем здесь технически простой метод трансфекции клеток в одной куриной ткани-ово, позволяя надежной линии трассировки, а также генетических манипуляций. Конкретные области ткани направлены в сегмент или нервной трубки, и ДНК вводится непосредственно в эпителии интерес, в результате спорадических трансфекции отдельных клеток. Использование репортеров, клональной населению, могут, следовательно, быть прослежены на срок до трех дней, и поведение генетически модифицированных клональной популяции могут быть по сравнению с контролем. Этот метод использует преимущества доступности куриного эмбриона, а также новые инструменты для генетических манипуляций. Мы сравниваем и обсудить его преимущества по сравнению с широко используемым методом электропорации, и возможные применения и использования в дополнительной в естественных условиях модели также предложил. Мы выступаем за использование этого метода, как существенное дополнение и дополнить существующие линии отслеживания и генетических инструментов вмешательства.
Protocol
1. Подготовка Микропипетки
Тянем наш пипетки на стандартном Narishige PP-83 пипетки съемник с тепловой установки 13.5. Точная установка должна быть откалибрована, направленных на диаметр кончика пипетки от 8 до 10 мкм. Мы используем нити содержащих боросиликатного стеклянные трубки с внешним диаметром 1,0 мм и внутренним диаметром 0.75-0.78 мм. Пипетки, следовательно, хранится в пластиковой посуды с советами защищен от контакта с края тарелки.
2. Подготовка ДНК
Плазмиды интересов трансфицировали в DH5α Е. палочка с помощью стандартных процедур. Ночь культуры из одной колонии используются для очистки плазмид использованием макси-приготовительные комплекты (любой коммерческой комплект должен сделать). Мы используем плазмиды концентрации 1,0 мкг / мкл для не-клональных инъекций. Более высокие концентрации увеличения засорения наконечники для пипеток. Для клональной приложений, плазмиды концентрациях значительно ниже, и должны быть скорректированы (см. ниже). Для pCAGG-GFP, оптимальной концентрации производства клональной результатам было установлено, что около 0,05-0,1 мкг / мкл. От одного до 2 мкл плазмиды обычно используется в эксперименте, и минимальное количество быстрых-зеленый порошок (придерживаясь кончик сухой, резко пипетки стеклянные) добавляется к плазмиды, прежде чем эксперимент начинается. Плазмиду затем центрифугируют в настольной центрифуге в течение 2 минут на максимальной скорости. Эта процедура, кажется, уменьшает пипетки-засорение проблем.
3. Введение эмбрионов
3.1 Подготовка эмбрионов
Мы используем перепелов, а также куриные яйца для инъекций. Яйца насиживают лежа на длинной оси до желаемой стадии развития. Яйца протереть 70% этанолом и высушивают. Заостренный конец яйцо прокалывают с хирургическими ножницами (это необходимо только в куриных яйцах) и 1 мл (в перепелов) или 2 мл (цыпленок) белка взята из яйца с 10 мл шприца (19G иглы). Отверстия затем опечатаны с горячим парафином.
До фактического инъекции, открывается окно в верхней части яичной скорлупы использованием хирургических ножниц. Размещение липкой ленты на оболочку и проходящем через это может помочь уменьшить мусор из оболочки. PBS буфера, содержащего антибиотики пипеткой непосредственно в яйцеклетку. Чтобы получить доступ эмбриона, желточного и / или амниотической мембраны вырезать и отвлекает использованием 0,14-миллиметровыми штекерами насекомых установлен на иглодержателя. Нетоксичные чернила (Пеликан # 17) вводится под бластодерма, чтобы помочь визуализировать эмбрион, используя пожарные вытащил капиллярной установлен на аспиратор.
3,2 Загрузка и установка микропипетки
Съемник микропипетки могут быть загружены с плазмидой огнестрельным вытащил капилляров адекватного диаметра, установлен на аспиратор. Минимальное количество плазмиды рисуется с помощью капиллярного и загружаются в пипетку с момента открытия противоположной заостренным кончиком, и приближается наконечник с внутренней стороны как можно больше. Пипетки, следовательно, загружены на ручной давления воздуха инжектор монтируется на микроманипулятора. Минимальное давление применяется, если это необходимо, для того, чтобы позволить плазмиды решение для достижения кончика пипетки.
3,3 плазмиды инъекции
Пипетки манипулируют в жидкой среде яйца при применении некоторых давление воздуха, чтобы предотвратить засорение кончика пипетки. Соответствующие домена ткани пронзили. Изменение давления, как кончик входит ткань достаточно часто, чтобы освободить плазмиды с видимым быстро зеленый. Если это не так, затем слегка давлением шприца до плазмиды / быстро зеленые выбрасываются. Этот процесс может повторяться вдоль оси эмбриона, например, в соседних сомитов или по степени нервной трубки. После инъекции, PBS может быть добавлен. Окна запечатаны использованием липкой ленты (парафильмом не желательно, особенно для перепелиных яиц повышает ставки зародыш смерти, возможно, блокируя обмен кислорода через оболочку). Лечение эмбрионов возвращаются в инкубатор. Избегайте вентиляции и разместить небольшие емкости с водой в инкубаторе, поскольку они помогают сохранить влагу и повышения урожайности.
4. Настройка параметров впрыска и мониторинг показателей успешности
Asessing и калибровки различных параметров инъекции имеет решающее значение для приложений, направленных на одноклеточных анализа. Не каждая инъекция событие приведет к успешной маркировки одной ячейки. Плазмиды концентрации, которая слишком высока, может привести к не-клональных маркировки, в то время очень низких концентрациях приводить к высоким показателям недостаточности. Концентрация вводят плазмиды должна быть оптимизирована для клональной инъекций. Мы рекомендуем разбавление всей очищенной плазмиды акции, а не разбавляя отдельных подготавливает к заранее определенной концентрации. Последнийможет ввести некоторые различия успеха ставок, вероятно, из-за изменений в чистоте и другие параметры, такие как доля суперспиральной плазмиды.
4,1 Оценка успеха ставки на весь наблюдения горе
Первоначальная оценка вводят эмбрионов может быть выполнен весь монтаж наблюдения под флуоресцентным бинокль. От шести до восьми часов после инъекции являются достаточными для оценки успеха ставки с pCAGG повышенной GFP конструкции. Это предусмотрено целевой сайт поверхностно достаточно, чтобы быть очевидной (например, спинной сомитов, спинной нервной трубки, эктодермы и т.д., см. Рисунок 1A-C.). Этот шаг является особенно полезным для оценки экспериментальных серий экспонирование либо слишком много меченых клеток или, наоборот, не имея флуоресцентных клеток. Если в дальнейшем инкубации желательно, антибиотики содержащие PBS раствор должен быть добавлен в яйце после просмотра и уплотнительная лента должны быть заменены.
4,2 Оценка клональности по серийному сечения анализ
Лучшее средство для оценки темпов успешных инъекций является серийно-секционирования вводят эмбрионов и использование иммуногистохимии для визуализации меченых клеток. В этих условиях, времени инкубации может быть как 4-х часов после инъекции. Эмбрионов фиксируются и обрабатываются для парафиновых срезов (или cryosectioning). Стекло монтажа разделы затем де-paraffinized и иммуно-витражи для репортера визуализации. Усиление методы, такие как биотин-стрептавидин было бы желательно. Наконец, серийных срезов, проверяются для обнаружения меченых клеток в вводили сегментов. Если после первоначального испытания нескольких, а не отдельные клетки получены, плазмиды запас должен быть разведен, и процесс повторяется, пока адекватные результаты будут достигнуты. От двух до 10-кратного разведения плазмиды маточного раствора может оказаться необходимым в случае успеха ставки слишком высоки.
Для каждой плазмиды для трансфекции, тщательная калибровка, что гарантирует клональности следует повторить.
5. Представитель Результаты
Мы обычно проводят однократное введение pCAGG-GFP в сегмент, в то время таргетинга 6-12 сегментов в эмбрионе 1 2. Под этот параметр, четкий сигнал может быть обнаружен целый наблюдения гору 8 часа после инъекции, хотя бы в одном сегменте одного эмбриона из десяти. В этих условиях, маркировка было дополнительно подтверждено быть клональной (рис. 1В, С). При использовании высоких концентраций ДНК, большинство эмбрионов могут проявлять хотя бы один успешный инъекции, повышение возможности того, что несколько ячеек были трансфекции.
Последовательный анализ показал, что раздел клональной трансфекции были достигнуты, когда вероятность успеха была около 10%. Это означает, что для достижения клональности, техника по определению, крайне неэффективно. С другой стороны, в этих условиях, более 93% положительных событий маркировки оказались клональной 1.
Рисунок 1. Клональный инъекции pCAGGS-GFP в нервные и скелетных прародителей. (AC) поперечном разрезе показывает маркировка спинной нервной трубки (NT) (), вентролатеральной области dermomyotome (DM) (В), или центральная DM лист (С) , 6hr после микроинъекции pCAGGS-GFP к одному прародителя. (D) два дня после клональной трансфекции центральном ДМ, одного прародителей порожденных производных в обоих дермы (D), а также мышцы (М) (см. ссылку 1. Подробнее).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше метод является модификацией ранее описанной техники для доставки липофильных красителей малого подмножества клеток или одной прародителей 3. Она имеет три основных преимущества по сравнению со стандартной техникой электропорации. Во-первых, она предоставляет средства для маркировки с уверенностью дискретных сайтов в тканях-мишенях, что позволяет гораздо больше, чем пространственное разрешение электропорации (см., например, рис 1B, С). Во-вторых, она позволяет маркировки отдельных клеток, что позволяет проследить их происхождение в естественных условиях при прочих нормальных условиях 1 2 (рис. 1в, г). В-третьих, ген Мисс-выражение в одноклеточных уровень обеспечивает инструментом для исследования молекулярных механизмов линии разделения, для изучения роли факторов роста или других генов на клеточном поведение в противном случае нормального фона и т.д. Поэтому этот метод дополняет Широко применяется электропорации технике, и в дальнейшем эксплуатирует доступности птичьего эмбриона в пространственно-временном регулируется приобретение и потеря функции гена в живом организме.
Больше соответствующего заявления является анализ клеточного поведения на одном уровне клетки (миграции клеток, аксонального руководства, деление клеток и т.д.) с использованием новейших технологий визуализации живых 4 5 6 7. В некоторых из этих экспериментальных условиях, было бы желательно использовать быстрой активации репортер видов (таких, как Венера-GFP) 8, с тем чтобы ранее визуализации вводили клетки.
Учитывая простоту метода здесь описано, то весьма вероятно, что он может быть применен и к другим моделям животных, таких как данио рерио и Xenopus. Система очень проста в настройке и использовании, и главная трудность генерирует достаточно большой серии меченых эмбрионов, а также сканирования для помеченных потомства в приложениях, требующих последовательных секций. В наши руки, вводили клетки выставлены GFP легко обнаружить сигнал на срок до 3 дней, но этот параметр, вероятно, зависит от скорости пролиферации клеток. Использование долгоживущих репортер, таких как Lac-Z, или транспозонов-опосредованного переноса генов, ведущих к стабильной интеграции 9, можно было бы продлить отслеживание потомства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Шломи Криспин для нейронных ЭОП. В частности, мы признаем, Юваль Корица для начала технику GFP трансфекции. Эта работа была поддержана грантами от Израиля научного фонда, ассоциации Francaise контр ле Миопатии и Deutche Forschungsgemeinshaft, совместные научно-исследовательский центр 488 до CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette tubes | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Insect needles | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
