Transfección de células individuales en embriones de pollo

Summary

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

Abstract

Un tema central en la biología del desarrollo es la diversificación de los linajes y la elucidación de los mecanismos subyacentes molecular. Esto implica un análisis exhaustivo de los destinos de las células individuales, en condiciones normales y experimentales. Con este fin, los métodos de transfección que se dirigen a los progenitores solo son un requisito previo. Se describe aquí un método técnicamente sencillo para la transfección de células individuales en los tejidos de pollo in ovo, lo que permite el rastreo fiable linaje, así como la manipulación genética. Dominios específicos de tejido son orientadas dentro de los somitas o del tubo neural, y el ADN se inyecta directamente en el epitelio de interés, lo que resulta en la transfección de células individuales esporádicos. Utilizando a los periodistas, poblaciones clonales en consecuencia, puede ser rastreado hasta por tres días, y el comportamiento de manipulados genéticamente poblaciones clonales se puede comparar con la de los controles. Este método tiene la ventaja de la accesibilidad del embrión de pollo, junto con nuevas herramientas para la manipulación genética. Comparar y discutir sus ventajas sobre el método de electroporación utilizadas, y las posibles aplicaciones y su uso en otros modelos in vivo también se proponen. Abogamos por el uso de este método como un complemento importante y se complementan para el linaje actual trazado y herramientas genéticas interferencia.

Protocol

1. Preparación de Micropipetas

Sacamos nuestras pipetas en un estándar Narishige extractor pp-83 pipetas con un ajuste de calor de 13,5. La configuración precisa debe ser calibrado, con miras a un diámetro de punta de la pipeta de entre 8 y 10 micras. Usamos filamento que contienen los tubos de vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,0 mm y diámetro interior de 0,75-0,78 mm. Las pipetas, en consecuencia, almacenados en un plato de plástico con las puntas protegidas del contacto con los bordes del plato.

2. Preparación de ADN

El plásmido de interés se transfecta en DH5a E. coli utilizando procedimientos estándar. Cultivos de una noche de las colonias solo se utilizan para purificar el plásmido con preparación maxi-kits (cualquier kit comercial debe hacer). Nosotros utilizamos una concentración del plásmido de 1,0 mg / l para los no clonal inyecciones. Las concentraciones más altas aumentan la obstrucción de las puntas de pipeta. Para aplicaciones clonal, las concentraciones de plásmido son mucho más bajos y se deben ajustar (ver más abajo). Para pCAGG-GFP, la concentración óptima producción clonal resultados se encontró que alrededor de 0,05-0,1 mg / l. Uno a 2 l de plásmido se utiliza normalmente por experimento, y una cantidad mínima de fast-verde en polvo (la adhesión a la punta de una pipeta seca, vidrio filoso) se añade a la plásmido antes de que el experimento comienza. El plásmido se centrifuga en una centrífuga de mesa durante 2 minutos a máxima velocidad. Este procedimiento parece reducir la obstrucción pipeta problemas.

3. La inyección de embriones

3.1 Preparación de los embriones

Usamos la codorniz, así como huevos de gallina para preparaciones inyectables. Los huevos se incuban acostado sobre su eje longitudinal hasta la etapa de desarrollo deseado. Los huevos se limpiaron con etanol 70% y se deja secar. La punta del huevo se perfora con una tijera quirúrgica (esto es necesario sólo en huevos de gallina) y 1 ml (en codornices) o 2 ml (pollo) de albúmina se extrae del óvulo con una jeringa de 10 ml (19G aguja). Los agujeros se sellan con parafina caliente.

Antes de la inyección actual, se abre una ventana en la parte superior de la cáscara de huevo con unas tijeras quirúrgicas. La colocación de cinta adhesiva sobre la cáscara y corte a través de ella puede ayudar a reducir los residuos de la cáscara. Tampón PBS que contiene antibióticos es una pipeta de inmediato en el óvulo. Para acceder a los embriones, la vitelina y / o membranas amnióticas se cortan y se desvía con 0,14 mm alfileres de insectos montados sobre un soporte de aguja. No es tóxico tinta (Pelican # 17) se inyecta debajo de la blastodermo para ayudar a visualizar el embrión, con un fuego tirado capilar montado en un aspirador.

3.2 Carga y montaje de micropipetas

El extractor de micropipetas se puede cargar con el plásmido de fuego tirado por los capilares de diámetro adecuado, montado sobre un aspirador. Una mínima cantidad de plásmido se dibuja con el capilar y se cargan en la pipeta de lo contrario la apertura a la punta afilada, y acercándose a la punta desde el interior tanto como sea posible. La pipeta, en consecuencia, cargado en una presión de aire inyector manual montado en un micromanipulador. Presión mínima se aplica, si es necesario, a fin de permitir la solución de plásmido para llegar a la punta de la pipeta.

3.3 de inyección de plásmido

La pipeta se manipula en el medio líquido del huevo mientras se aplica una presión de aire para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta. El dominio del tejido relevante es traspasado. El cambio en la presión como la punta entra en el tejido es a menudo suficiente para liberar el plásmido con el verde rápido visible. Si este no es el caso, aplicar una ligera presión a la jeringa hasta que el verde plásmido / rápido son expulsados. Este proceso se puede repetir a lo largo del eje del embrión, por ejemplo, en somitas adyacentes oa lo largo de la extensión del tubo neural. Después de las inyecciones, PBS se puede añadir. La ventana está sellado con cinta adhesiva (parafina no es deseable, especialmente para los huevos de codorniz, que aumenta las tasas de muerte de embriones, probablemente mediante el bloqueo de intercambio de oxígeno a través de la cáscara). Los embriones tratados se devuelven a la incubadora. Evitar la ventilación y colocar pequeños recipientes con agua en la incubadora ya que ayudan a mantener los rendimientos y aumentar la humedad.

4. Ajuste de los parámetros de inyección y de seguimiento las tasas de éxito

Asessing y calibración de los diferentes parámetros de la inyección es crítico para las aplicaciones destinadas a una sola célula de análisis. No todos los eventos de inyección llevará al etiquetado de éxito de una sola célula. Concentración de plásmido que es demasiado alto puede llevar a no clonal de etiquetado, mientras que el resultado concentraciones muy bajas en las tasas de fracaso. La concentración de la inyección del plásmido debe ser optimizado para inyecciones clonal. Se recomienda la dilución de la totalidad de acciones plásmido purificado en lugar de diluir preparaciones individuales a una concentración predeterminada. Este últimopodría introducir alguna variación de las tasas de éxito, probablemente debido a las variaciones en la pureza y otros parámetros tales como la proporción de plásmido superenrollado.

4.1 Evaluación de las tasas de éxito por toda la observación de montaje

Evaluación inicial de los embriones inyectados pueden ser realizadas por todo el montaje de observación bajo un binocular fluorescentes. Seis a ocho horas después de la inyección son suficientes para evaluar las tasas de éxito con una construcción de buenas prácticas agrarias pCAGG mejorada. Esto es siempre que el sitio de destino es superficial suficiente para ser evidentes (por ejemplo, el somite dorsal, dorsal del tubo neural, etc ectodermo, ver Figura 1-C.). Este paso es especialmente útil para la evaluación de sus series experimentales exhiben ya sea células marcadas demasiados o, alternativamente, a falta de la presencia de células fluorescentes. Si se desea más de incubación, los antibióticos que contienen una solución de PBS, debe añadirse a la del huevo y después de ver la cinta de sellado debe ser reemplazado.

4.2 La evaluación de clonalidad mediante el análisis de serie de la sección

El mejor medio para evaluar las tasas de éxito de las inyecciones es de serie-el corte embriones inyectados y el uso de inmunohistoquímica para visualizar las células marcadas. En estas condiciones, los tiempos de incubación puede ser tan corto como 4 horas después de la inyección. Los embriones son fijados y procesados ​​para la sección de parafina (o muestras criostáticas). Montado de vidrio secciones se de-paraffinized e inmuno-tinción para visualizar el reportero. Métodos de amplificación tales como biotina-estreptavidina que sería deseable. Finalmente, los cortes seriados se analizan para detectar células marcadas en los segmentos inyectados. Si después de varios ensayos iniciales en vez de células individuales se obtienen, las acciones plásmido debe ser diluido y el proceso se repite hasta que los resultados se logran adecuadas. De dos a 10 diluciones de la solución del plásmido puede ser necesario en los casos de las tasas de éxito son demasiado altos.

Para cada plásmido se transfectadas, una calibración completa que asegura clonalidad se debe repetir.

5. Resultados representante

Por lo general llevar a cabo una sola inyección de pCAGG-GFP por somite, mientras que 12.6 por dirigirse a segmentos de embriones ^{1 2.} Bajo este contexto, una clara señal puede ser detectada por la observación todo el montaje 8 horas de la inyección, en al menos un segmento de un embrión de cada diez. En estas condiciones, el etiquetado se confirmó que se clonal (Figura 1 B, C). Cuando se utilizan altas concentraciones de ADN, la mayoría de los embriones pueden presentar al menos una inyección de éxito, aumentando la posibilidad de que varias celdas han sido transfectadas.

Análisis de la sección de serie reveló que transfecciones clonal se alcanza cuando la tasa de éxito fue del 10%. Esto significa que a fin de lograr clonalidad, la técnica es por definición, altamente ineficiente. Por otro lado, en estas condiciones, más del 93% de los eventos etiquetado positivo se encontró que ^una clonal.

Figura 1. Inyecciones clonal de pCAGGS-GFP en células progenitoras neurales y esquelético. (AC) que muestra las secciones transversales de etiquetado de la dorsal del tubo neural (NT) (A), el dominio ventrolateral de la dermomiotoma (DM) (B), o una hoja de DM central (C) , 6 h después de la microinyección de pCAGGS-GFP con un solo progenitor. (D) Dos días después de la transfección de clones de la central de progenitores DM, solo genera derivados, tanto en la dermis (D), así como el músculo (M) (ver ref. ¹ para más detalles).

Discussion

El método descrito anteriormente es una modificación de una técnica descrita anteriormente para la entrega de colorantes lipofílicos a los subconjuntos de células pequeñas o progenitores solo ^3. Tiene tres ventajas principales sobre la técnica de electroporación estándar. En primer lugar, proporciona un medio para el etiquetado de los sitios de confianza discreto en los tejidos, lo que permite una resolución mucho mayor espacio que la electroporación (véase, por ejemplo, la figura 1B, C). En segundo lugar, permite el etiquetado de las células individuales, lo que permite rastrear su linaje in vivo bajo condiciones normales de lo contrario ^{1 2} (Figura 1 C, D). En tercer lugar, el gen se pierda la expresión a nivel de una sola célula proporciona una herramienta para investigar los mecanismos moleculares de la segregación linaje, para estudiar el papel de factores de crecimiento o de otros genes en el comportamiento celular en un fondo por lo demás normales, etc Por lo tanto, este método complementa la técnica de electroporación se aplica ampliamente, y además explota la accesibilidad del embrión aviar de espacio-temporalmente la ganancia y la pérdida de regulación de la función génica in vivo.

Una aplicación cada vez más relevante es el análisis de los comportamientos celulares a nivel de célula única (la migración celular, la guía axonal, la división celular, etc), utilizando nuevas tecnologías de la imagen en vivo ^{4 5 6 7.} En algunos de estos parámetros experimentales, podría ser conveniente utilizar una especie de reportero de activación rápida (como Venus-GFP) ⁸ a fin de permitir una visualización antes de la célula inyectados.

Dada la sencillez del método aquí descrito, es muy probable que también se podría aplicar a otros modelos animales como el pez cebra y Xenopus. El sistema es muy fácil de configurar y utilizar, y la dificultad principal es la generación de series suficientemente grande de embriones etiquetados, así como la exploración de la progenie etiquetado en aplicaciones que requieren de serie de secciones. En nuestras manos, las células inyectadas exhiben una señal de las buenas prácticas agrarias fácilmente detectable durante un máximo de 3 días, pero este parámetro es probable que dependa de las tasas de proliferación celular. El uso de un periodista de larga duración como Lac-Z, o transposón mediada por la transferencia de genes que conducen a la integración estable ^9, podría ser posible prolongar el rastreo de la descendencia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B