Summary
Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.
Abstract
Gelişimsel biyoloji merkezi bir tema soyları çeşitlendirilmesi ve altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması. Bu normal ve deneysel koşullar altında tek hücre kaderi ayrıntılı bir analiz gerektirir. Bu amaçla, tek atalarıdır hedef transfeksiyon yöntemleri bir önkoşuldur. Biz burada, yanı sıra genetik manipülasyon izleme güvenilir soyu, tavuk-ovo dokuların tek hücre transfecting sağlayan bir teknik olarak basit bir yöntem açıklanmaktadır. Özgül doku etki hücre gruplarının ya da nöral tüp içinde hedeflenen ve DNA tek hücre sporadik transfeksiyon ilgi epitel içine doğrudan enjekte edilir. Gazetecilere kullanarak klonal popülasyonları dolayısıyla üç gün için takip edilebilir ve genetik olarak manipüle klonal popülasyonlarının davranış kontrolleri ile mukayese edilebilir. Bu yöntem, genetik manipülasyon için yeni araçlar ile birlikte civciv embriyo erişilebilirlik yararlanır. Biz karşılaştırın ve yaygın olarak kullanılan elektroporasyon yöntemi daha fazla avantaj ve olası uygulamaları tartışmak ve ek in vivo modellerde de önerilmektedir. Biz mevcut soy izleme ve genetik etkileşim araçları için önemli bir ek ve tamamlayıcı olarak bu yöntemin kullanılmasını savunan.
Protocol
1. Mikropipetler hazırlanması
Biz, bir ısı ayarı ile 13.5 standart Narishige pp-83 pipet çektirmesi pipetler çekin. Hassas ayar bir pipet ucu çapı 8 ila 10 mikron amaçlayan, kalibre edilmesi gerekir. Filament içeren bir dış çapı 1.0 mm ve iç çapı 0,75-0,78 mm ile borosilikat cam tüpler kullanır. Pipetler, plastik bir tabak çanağın kenarları ile temas korunan ipuçları dolayısıyla saklanır.
2. DNA hazırlığı
Ilgi plazmid DH5α E. transfekte standart prosedürler kullanarak coli. Gecelik kültürlerin tek koloniler plazmid kullanarak maxi-hazırlık setleri (herhangi bir ticari kit yapmalıyım) arındırmak için kullanılır. Biz, 1.0 mg / ml-klonal olmayan enjeksiyonlar için bir plazmid konsantrasyon kullanın. Yüksek konsantrasyonlarda pipet uçları tıkanma artırmak. Klonal uygulamalar için, plazmid konsantrasyonları çok düşüktür ve ayarlanabilir olmalıdır (aşağıya bakın). PCAGG-GFP, klonal sonuçlar üreten optimal konsantrasyonu yaklaşık 0.05-0.1 mcg / ml olarak bulundu. Plazmid biri 2 mcL genellikle Deneme başına kullanılır, deney başlamadan önce en az bir fast-yeşil toz miktarı (kuru, keskin cam pipet ucu bağlı kalarak) plazmid eklenir. Plazmid sonra, 2 dakika süreyle maksimum hızda bir masaüstü santrifüj santrifüj. Bu prosedür, pipet tıkanma sorunları azaltmak için gibi görünüyor.
3. Embriyoların Enjeksiyon
3.1 Hazırlık embriyoların
Biz enjeksiyon için bıldırcın yanı sıra tavuk yumurtası kullanın. Yumurtalar istenilen gelişim aşamasına kadar uzun ekseni üzerinde yatarken inkübe edilir. Yumurta% 70 etanol ile temizlenmesi ve kuruması için izin verilir. Yumurtanın sivri ucu cerrahi makas (bu sadece tavuk yumurtası gerekli) ve 1 ml (bıldırcın) ya da 10 ml şırınga ile (19G iğne), yumurta çekilir akı, 2 ml (civciv) ile deldi. Delikler daha sonra sıcak parafin ile mühürlenir.
Gerçek enjeksiyon öncesinde, cerrahi makas kullanarak yumurta kabuğunun üst kısmında bir pencere açıldı. Kabuk üzerindeki yapışkan bandı yerleştirilmesi ve bunun üzerinden kesme, kabuk enkaz azaltmaya yardımcı olabilir. Antibiyotik içeren PBS yumurtanın içine hemen pipetlenir. Embriyo erişmek için, vitellin ve / veya amniyotik membranlar kesilir ve bir iğne tutucu üzerine monte 0.14 mm böcek pimleri kullanılarak yönlendirilir. Toksik olmayan mürekkep (Pelican # 17) kullanılarak, embriyo görselleştirmek yardımcı olmak için blastodermin altına enjekte edilir bir aspiratör monte kapiller yangın çıkardı.
3.2 mikropipetler yükleme ve montaj
Plazmid, çektirmesi mikropipetler bir aspiratör üzerine monte edilmiş, yeterli çaplı yangın çekti kılcal damarlar tarafından yüklenebilir. Az miktarda plazmid bir açılış tersi bilenmiş ucu pipet içine kılcal ve yüklü kullanarak ve mümkün olduğu kadar içeriden ucu yaklaşırken çizilir. Pipet enjektör bir micromanipulator üzerine monte edilmiş bir manuel hava basıncı dolayısıyla yüklenir. Minimum basınç pipet ucu ulaşmak için plazmid çözüm sağlamak amacıyla, gerektiğinde uygulanır.
3.3 Plazmid enjeksiyon
Pipet, pipet tıkanmasını önlemek için bazı hava basıncı uygulayarak, yumurta sıvı ortama manipüle. Ilgili doku etki deldi. Ucu doku girerken basınç değişim genellikle görünür hızlı yeşil plazmid serbest bırakmak için yeterli. Bu durumda değilse, hızlı / plazmid yeşil çıkarılana kadar, şırınga hafif basınç uygulayın. Bu süreç, komşu Somitlerin örneğin ya da nöral tüp ölçüde boyunca, embriyonun ekseni boyunca tekrar edilebilir. Enjeksiyonları takiben, PBS ilave edilebilir. Parafilm özellikle bıldırcın için arzu edilen yumurta kabuk yoluyla oksijen alışverişini engelleyerek muhtemelen, embriyo ölüm oranlarını artıran bir yapışkan bant kullanarak pencere kapatılır. Tedavi edilen embriyoların bir kuluçka iade edilir. Havalandırma kaçının ve nem ve artış verimleri korumaya yardımcı inkübatör su ile küçük kaplar.
4. Enjeksiyon Parametrelerin ayarlanması ve Başarı Oranları İzlenmesi
Asessing ve çeşitli enjeksiyon parametreleri kalibre tek hücreli analiz amaçlayan uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Her enjeksiyon olay değil, tek bir hücre başarılı bir şekilde etiketlenmesine neden olacaktır. Plazmid konsantrasyonu çok yüksek, yüksek başarısızlık oranları çok düşük konsantrasyonlarda ise non-klonal etiketleme yol açabilir. Klonal enjeksiyonları enjekte edilen plazmid konsantrasyon için optimize edilmiş olmalıdır. Biz tüm saflaştırılmış plazmid stok seyreltme yerine, önceden belirlenmiş bir konsantrasyon bireysel preparatlarıyla seyreltilmesi önerilir. İkincisisaflık ve supercoiled plazmid oranı gibi diğer parametreler farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla başarı oranları, bazı varyans tanıtmak olabilir.
4.1 bütün montaj gözlem ile başarı oranları değerlendirilmesi
Floresan bir binoküler altında bütün montaj gözlem tarafından enjekte edilen embriyoların İlk değerlendirme yapılabilir. Enjeksiyon sonrası altı ila sekiz saat pCAGG geliştirilmiş bir GFP inşa başarı oranlarını değerlendirmek için yeterli. Bu hedef siteye kolayca görünür olmak için yeterli yüzeysel (örneğin dorsal hücre gruplarının, dorsal nöral tüp, ektoderm vb, Şekil 1A-C bakın.) Sağlanır. Bu adım çok sayıda etiketli hücreleri veya alternatif olarak, herhangi bir flüoresan hücreleri eksik ya sergileyen deneysel serisi değerlendirmek için yararlıdır. Daha fazla inkübasyon isteniyorsa, antibiyotik içeren PBS çözüm görüntüledikten sonra yumurta eklenir ve sızdırmazlık bandı değiştirilmesi gerekir.
4.2 seri kesit analizi ile değerlendirilmesi klonalite
Enjekte edilen embriyolar seri-kesit ve etiketli hücreleri görselleştirmek için immünhistokimya kullanarak başarılı enjeksiyonları oranlarını değerlendirmek için en iyi yol. Bu koşullar altında, kuluçka süresi, enjeksiyon sonrası 4 saat kadar kısa olabilir. Embriyolar sabit ve parafin kesit (ya da cryosectioning) işlenir. Cam monte bölümleri de paraffinized ve muhabir görünüm için immüno-lekeli. Çoğaltma yöntemleri gibi biotin streptavidin gibi arzu olabilir. Son olarak, seri bölümler etiketli hücreleri enjekte segmentleri algılamak için taranır. Tek hücre yerine birden fazla elde edilen ilk denemeleri üzerine, plazmid stok seyreltilmiş olmalı ve yeterli sonuçlar elde kadar işlem tekrarlanır. Plazmid stok solüsyonu İki ila 10 kat dilüsyonlarının başarı oranları çok yüksek olan durumlarda gerekli olabilir.
Plazmid transfekte olması için, klonalite sağlayan kapsamlı kalibrasyon tekrar edilmelidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Embriyo 1 2 başına 6-12 segmentleri hedef alırken genellikle, tek bir enjeksiyon hücre gruplarının ortalama pCAGG-GFP yürütmek. Bu ayarı altında, açık bir sinyal en az bir on bir embriyo segmentinde tüm montaj gözlem 8 saat enjeksiyon tarafından tespit edilebilir. Bu koşullar altında, etiketleme daha klonal (Şekil 1B, C) olarak teyit edilmiştir. Yüksek DNA konsantrasyonları kullanırken, birden fazla hücreyi transfekte olduğunu olasılığını artıran en embriyolar, en az bir başarılı bir enjeksiyon gösterebilir.
Seri bölüm analizi başarı oranı yaklaşık% 10 iken klonal transfections ulaşılmıştır saptandı. Bu klonalite ulaşmak için, teknik, tanım başına son derece verimsiz olduğunu anlamına gelir. Öte yandan, bu koşullar altında, olumlu etiketleme olayların% 93 daha fazla klonal 1 bulundu.
Şekil 1. Sinir ve iskelet atalarıdır içine pCAGGS-GFP Klon enjeksiyonları dorsal nöral tüp etiketleme (NT) (A), dermomyotome (DM) (B) ventrolateral etki alanı veya merkezi DM levha (C) gösteren (AC) Enine bölümleri , tek bir progenitör pCAGGS-GFP mikroenjeksiyon sonrası 6hr. (D), dermis (D) yanı sıra kas (M) (ref bakın. Ayrıntılar için 1) türevleri oluşturulan merkezi DM, tek atalarıdır klonal transfeksiyon takip eden iki gün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan yöntem, küçük hücre alt grupları veya tek atalarıdır 3 lipofilik boyalarla teslim için önceden açıklanan teknik bir değişiklik . Bu standart elektroporasyon tekniği üzerinde üç ana avantajı vardır. İlk olarak, elektroporasyon daha yüksek uzaysal çözünürlük (C, örneğin Şekil 1B) sağlayan, hedef dokular olan güveni ayrık siteleri ile etiketlenmesi için bir araç sağlar. İkincisi, bu nedenle, normal koşullar 1 2 (Şekil 1C, D) altında in vivo soy izlemek için izin veren, tek hücre etiketlenmesi izin verir. Üçüncü olarak, tek hücre düzeyinde gen miss-ifadesi, normal bir arka planda büyüme faktörleri veya diğer genlerin rolü hücresel davranışı üzerinde çalışmak için soy segregasyon, moleküler mekanizmaları araştırmak için bir araç sağlar, vb Bu nedenle, bu yöntem tamamlar elektroporasyon tekniği, yaygın olarak uygulanan ve daha fazla uzay-zamansal olarak düzenlenir kazanç ve in vivo gen fonksiyon kaybı kuş embriyo erişilebilirlik patlatır.
Giderek daha ilgili başvuru, tek hücre düzeyinde (hücre migrasyonu, aksonal rehberlik, hücre bölünmesi gibi) ortaya çıkan canlı görüntüleme teknolojileri 4 5 6 7 kullanarak hücresel davranışları analiz . Bu deneysel bazı ayarları, enjekte edilen hücrenin daha önceki bir görselleştirme izin hızlı bir aktivasyon muhabiri türü (örneğin, Venüs-GFP) 8 amacıyla kullanmayı tercih olabilir.
Burada açıklanan yöntem sadeliği göz önüne alındığında, Zebra balığı ve Xenopus gibi diğer hayvan modelleri için de uygulanabilir olduğunu kuvvetle muhtemeldir. Sistem kurulumu ve kullanımı çok kolaydır, ve ana zorluk etiketli embriyoların yeterince büyük seri üreten yanı sıra seri kesitler gerektiren uygulamalar etiketli döl için tarıyor. Bizim ellerde, enjekte edilen hücrelerin, 3 gün kadar bir kolay algılanabilir, GFP sinyali sergiledi, ancak bu parametre muhtemelen hücre proliferasyonu oranları bağlıdır. Lac-Z gibi uzun ömürlü muhabiri, ya da stabil entegrasyon 9 giden transpozon aracılı gen transferi kullanarak, soy izleme uzatmak mümkün olabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Shlomi Krispin nöral tüp görüntü için teşekkür ederiz. Özellikle, GFP transfeksiyon tekniği başlatmak için Yuval Tarçın kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma, CK, İsrail Bilim Vakfı, Derneği Francaise contre les Miyopatiler, ve Deutche Forschungsgemeinshaft Arastırma Merkezi 488 hibe tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipette tubes | Sutter Instrument Co. | B100-75-10 | |
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | |
| Insect needles | Watkins Doncaster | E6871 | |
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
References
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
