Single Cell Transfektion i kycklingembryon

Summary

Använda fin spets mikropipetter vi injicerar plasmid DNA i subdomäner av kyckling somites eller neural rör. Koncentrationen av plasmiden är anpassat för att generera enstaka transfekterade celler. Vi låter sedan de celler att utvecklas till klonat populationer.

Abstract

Ett centralt tema i utvecklingsbiologi är diversifiering av linjerna och att klarlägga bakomliggande molekylära mekanismer. Detta innebär en grundlig analys av öden enskilda celler under normala och experimentella förhållanden. För detta ändamål transfektion metoder som riktas mot en enda stamceller är en förutsättning. Vi beskriver här en tekniskt enkel metod för transfecting enstaka celler i kyckling vävnader i-ovo, vilket gör att tillförlitliga härkomst spårning och genmanipulation. Specifik vävnad domäner är riktade i somit eller neuralrörsdefekter, och DNA injiceras direkt i epitelet av intresse, vilket resulterar i sporadiska transfektion av enskilda celler. Använda reportrar kan klonal populationer därmed spåras i upp till tre dagar, och beteendet hos genmanipulerade klonal populationer kan jämföras med det av kontrollerna. Denna metod utnyttjar tillgängligheten till kycklingembryo tillsammans med nya verktyg för genetisk manipulation. Vi jämför och diskutera dess fördelar jämfört med utbredda elektroporation metoden, och möjliga tillämpningar och användning i ytterligare in vivo-modeller är också föreslås. Vi förespråkar användandet av denna metod som ett viktigt tillskott och komplement till befintliga härstamning spåra och genetiska verktyg störningar.

Protocol

1. Beredning av Mikropipetter

Vi drar vårt pipetter på en standard Narishige PP-83 pipett avdragare med ett värmeläge på 13,5. Den exakta inställningen måste kalibreras, som syftar till en pipettspets diameter på mellan 8 och 10 mikrometer. Vi använder oss av glödlampor som innehåller borosilikatglas rör med en yttre diameter på 1,0 mm och innerdiameter 0,75-0,78 mm. Den pipetter därför lagras i en plast skål med tips skyddas från kontakt med kanterna på skålen.

2. DNA-preparation

Den plasmid av intresse är transfekterade i DH5α E. coli med vanliga procedurer. Övernattning kulturer från enstaka kolonier används för att rena plasmiden med maxi-prep kit (något kommersiellt kit borde göra). Vi använder en plasmid koncentration av 1,0 mikrogram / mikroliter för icke-klonat injektioner. Högre koncentrationer ökar igensättning av pipettspetsar. För klonat applikationer, plasmid halterna är mycket lägre och måste justeras (se nedan). För pCAGG-GFP, har den optimala koncentrationen producera klonal träffar till ca 0,05-0,1 mikrogram / mikroliter. En till två mikroliter av plasmiden används vanligtvis per försök, och en minimal mängd av snabb-grönt pulver (som ansluter sig till toppen av en torr, vass glaspipett) läggs till i plasmiden före försöket börjar. Den plasmid sedan centrifugeras i en bordsskiva centrifug i 2 minuter vid maximal hastighet. Detta förfarande tycks minska pipett-igensättning problem.

3. Injektion av embryon

3.1 Beredning av embryon

Vi använder vaktel samt ägg kyckling för injektionsvätskor. Äggen inkuberas ligger på deras långa axeln tills önskad utvecklingsstadiet. Äggen tvättas med 70% etanol och torka. Den spetsiga änden av ägget är genomborrad med kirurgisk sax (detta är nödvändigt endast i hönsägg) och 1 ml (i vaktlar) eller 2 ml (chick) av äggvita tas från ägget med en 10 ml spruta (19G nål). Hålen är sedan förseglad med paraffin.

Före själva injektionen, ett fönster öppnas i toppen av äggskal med hjälp av kirurgisk sax. Placering tejp över skalet och skär genom det kan bidra till att minska skräp från skalet. PBS-buffert som innehåller antibiotika är pipetteras direkt in i ägget. För att komma åt embryot, är vitelline och / eller fostervatten membran klippa och avledas med hjälp av 0,14 mm insekt stift monteras på en nål. Giftfri trycksvärta (Pelican # 17) injiceras under BLASTODERM att hjälpa till att visualisera ett embryo med en brand drog kapillära monterad på en aspirator.

3,2 Lastning och montering av mikropipetter

Avdragarsatsen mikropipetter kan laddas med hjälp av plasmiden genom eld drog-kapillärer tillräcklig diameter monterad på en aspirator. En minimal mängd plasmid dras med kapillär och lastas in i pipetten ur dess öppning mitt emot vässade spetsen, och närmar sig toppen från insidan så mycket som möjligt. Pipetten är således lastas på en manuell lufttryck injektor monterad på en mikromanipulator. Minimalt tryck tillämpas, om nödvändigt, så att plasmiden lösningen för att nå toppen av pipetten.

3,3 Plasmid injektion

Pipetten manipuleras i vattnet av ägget samtidigt tillämpa vissa lufttryck för att förhindra igensättning av pipettspetsen. Den relevanta vävnaden domänen är perforerad. Förändringen i tryck när spetsen tränger in i vävnaden är ofta tillräckligt för att släppa plasmid med synliga snabbt grönt. Om så inte är fallet, applicera lätt tryck på sprutan tills plasmiden / snabba gröna har matats ut. Denna process kan upprepas längs axeln av embryot, till exempel i angränsande somites eller längs omfattningen av neuralrörsdefekter. Efter injektioner kan PBS läggas till. Fönstret är förseglade med tejp (parafilm inte är önskvärt speciellt för vaktelägg-det ökar priserna embryo död, troligen genom att blockera utbytet av syre genom skalet). Det behandlade embryon återförs till en inkubator. Undvik ventilation och placera små behållare med vatten i inkubatorn, eftersom de hjälper till att bibehålla fukt och öka avkastningen.

4. Justera Injection Parametrar och övervakning Framgång priser

Asessing och kalibrera olika injektion parametrar är avgörande för applikationer som syftar till encelliga analys. Inte varje injektion händelse kommer att leda till framgångsrik märkning av en enda cell. Plasmid koncentration som är för hög kan leda till icke-klonat märkningen, med mycket låga koncentrationer resultera i höga felfrekvens. Koncentrationen av det injicerade plasmiden måste optimeras för klonat injektioner. Vi rekommenderar utspädning av renat hela plasmiden lager snarare än att späda enskilda Preps till en förutbestämd koncentration. Den senarekan introducera några varians svarsfrekvensen, troligen beroende på variationer i renhet och andra parametrar såsom andelen supercoiled plasmid.

4,1 Bedöma framgångsrika genom hela montera observation

Första bedömning av injicerade embryon kan utföras av hela montera observation under ett fluorescerande kikare. Sex till åtta timmar efter injektion är tillräckliga för att bedöma framgången priser med en pCAGG med utökad GFP konstruktion. Detta är under förutsättning att målsidan är ytlig nog att vara lätt att identifiera (t.ex. rygg somit, rygg neuralrörsdefekter, ektoderm mm, se Figur 1A-C.). Detta steg är särskilt användbar för att utvärdera experimentella serien uppvisar antingen för många märkta celler eller alternativt saknar fluorescerande celler. Om ytterligare inkubation önskas, bör antibiotika som innehåller PBS lösningen tillsättas i ägget efter visning och förseglingstejpen bör bytas ut.

4,2 Bedöma clonality av serie-avsnitt analys

Det bästa sättet för att bedöma andelen lyckade injektioner är genom seriellt-sektionering injiceras embryon och med immunhistokemi för att visualisera den märkta cellerna. Under dessa förhållanden kan inkubationstiderna vara så kort som 4 timmar efter injektion. Embryona är fasta och bearbetas för paraffin sektionering (eller cryosectioning). Glas monterade delar är sedan de-paraffinized och immuno-färgas för reporter visualisering. Förstärkning metoder såsom biotin-streptavidin kan vara önskvärt. Slutligen är de seriella avsnitten scannas för att upptäcka märkta celler i injiceras segment. Om vid första försöken flera snarare än enskilda celler erhålls måste plasmid lagret spädas och processen upprepas tills tillräckligt resultat uppnås. Två till 10-faldig utspädningar av plasmiden stamlösningen kan vara nödvändigt i fall av svarsfrekvensen blir för hög.

För varje plasmid ska transfekterade bör en grundlig kalibrering som garanterar clonality upprepas.

5. Representativa resultat

Vi utför vanligen en enda injektion av pCAGG-GFP per somit, medan inriktning 6-12 segment per embryo ^{1 2.} Under denna inställning kan en tydlig signal detekteras med hela montera observation 8 timmar efter injektion, i åtminstone en del av ett embryo av tio. Under dessa förhållanden var märkning bekräftades att klonal (Figur 1B, C). När man använder höga DNA-koncentrationer kan de flesta embryon uppvisa minst en lyckad injektion, öka möjligheten att flera celler har transfekterade.

Serial avsnitt analys visade att klonal transfections uppnåddes när svarsfrekvens ca 10%. Detta innebär att för att uppnå clonality, är den teknik per definition mycket ineffektiv. Å andra sidan, under dessa förhållanden var mer än 93% av positiv märkning händelser visar sig vara klonat ^1.

Figur 1. Clonal injektioner av pCAGGS-GFP i neurala och skelett stamceller. (AC) tvärbalkarna visar märkning av rygg neuralrörsdefekter (NT) (A), ventrolaterala domänen för dermomyotome (DM) (B), eller centrala DM ark (C) , 6 timmars efter mikroinjektion av pCAGGS-GFP till en enda stamfader. (D) Två dagar efter klonal transfektion av de centrala DM, enda stamceller genererade derivat i både dermis (D) samt muskel (M) (se ref. ¹ för detaljer).

Discussion

Metoden som beskrivs ovan är en modifiering av ett tidigare beskrivits teknik för att leverera lipofila färgämnen till småcellig undergrupper eller enstaka stamfäder ^3. Det har tre huvudsakliga fördelar jämfört med vanliga elektroporation teknik. Det första ger det en möjlighet för märkning med tillförsikt diskreta platser i målvävnader, så mycket större rumslig upplösning än elektroporation (se till exempel Figur 1B, C). För det andra tillåter det märkning av enskilda celler, vilket gör det möjligt att spåra deras härkomst in vivo i övrigt normala förhållanden ^{1 2} (Figur 1C, D). Det tredje ger gen miss-uttryck vid encelliga nivå ett verktyg för att undersöka molekylära mekanismer härstamning segregering, för att studera rollen av tillväxtfaktorer eller andra gener på cellulär beteende i en annars normal bakgrund, etc. Därför kompletterar denna metod de i stor utsträckning elektroporation teknik och ytterligare utnyttjar tillgängligheten till aviär embryot till rums-tidsmässigt reglerat vinst och förlust av geners funktion in vivo.

En allt relevant tillämpning är en analys av cellulära beteenden vid enstaka cell nivå (cell migration, axonal vägledning, celldelning etc.) med ny live-imaging-teknik ^{4 5 6 7.} I vissa av dessa experimentella inställningar kan det vara önskvärt att använda en snabb aktivering reporter arter (såsom Venus-GFP) ⁸ för att möjliggöra en tidigare visualisering av den injicerade cellen.

Med tanke på enkelhet i metoden här beskrivs, är det mycket troligt att den också skulle kunna tillämpas på andra djurmodeller såsom Zebrafish och Xenopus. Systemet är mycket lätt att installera och använda, och den stora svårigheten är att generera tillräckligt stora serier av märkta embryon, samt scanning för märkta avkommor i applikationer som kräver serie-avsnitt. I våra händer, uppvisade injicerade cellerna ett enkelt kan upptäckas GFP signalen upp till 3 dagar, men denna parameter är sannolikt att bero på andelen cellproliferation. Med hjälp av en långlivad reporter som Lac-Z, eller transposon-medierad genöverföring leder till stabil integrering ^9, kan det vara möjligt att förlänga spårning av avkomman.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipette tubes	Sutter Instrument Co.	B100-75-10
Capillaries	Drummond Scientific	2-000-100
Insect needles	Watkins Doncaster	E6871
Pen-Strep solution	Biological Industries	03-031-1B