Summary
Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit hoher Ausbeute.
Abstract
Gereinigte DNA-Fragmente werden für verschiedene Zwecke in Molecular Biology eingesetzt und sie können durch mehrere Verfahren hergestellt werden. Die meisten von ihnen erfordern eine vorherige Elektrophorese der DNA-Fragmente, um die Band von Interesse zu trennen. Dann wird dieses Band aus einem Agarose oder Acrylamid Gel ausgeschnitten und gereinigt, indem Sie entweder: Bindung und Elution aus Glas oder Silica-Partikel, DEAE-Cellulose-Membranen, "crush und genießen Methode", Elektroelution oder sehr oft teuren kommerziellen Aufreinigungskits. So wird die Auswahl einer Methode hängt vor allem von dem, was im Labor zur Verfügung. Die Elektroelution Verfahren erlaubt es, sehr sauber DNA in einer Vielzahl von Anwendungen (Sequenzierung, Radiomarkierung, enzymatische Restriktion, enzymatische Modifikation, Klonen usw.) verwendet werden zu reinigen. Dieses Verfahren besteht in Platzierung DNA-Bande enthaltende Agarose oder Acrylamid Scheiben in Probenvertiefungen der electroeluter, dann Anlegen von Strom wird das DNA-Fragment auf die Agarose zu verlassen und damit in ein Kissen Salz gefangen werden, um später durch Ethanolfällung gewonnen werden.
Protocol
- Um DNA-Fragmente von Interesse zu reinigenden wählen, sollten diese in Agarose aufgelöst werden oder Acrylamidgelen Gel mit Ethidiumbromid durch Elektrophorese mit 0,5 X TBE-Puffer (Tris-Borat, EDTA) bei 120 Volt für 1 Stunde gefärbt. Dafür ~ 700 ng Plasmid pProEx-GdMre11S (6000-bp), die zuvor mit NdeI und HindIII verdaut wurde ein 900-bp-Fragment (560 ng Plasmid und 84 ng des Fragments) freizugeben.
- Die electroeluter Tank (Abbildung 1) sollte mit 0,5 X TBE gleichermaßen in jeder Seite der Mitte Plateau verteilt ausgefüllt werden betreut nicht verschütten es auf die Mitte der Hochebene.
- Die ausgewählten Bands (oder Bands) aus dem Gel ausgeschnitten, und in Probenkammer so nah wie möglich an den V-Kanal (eine Scheibe pro Well). Laufpuffer sollte jeder Kammer hinzugefügt werden; gerade genug, um das Gel Scheibe abdecken.
- Jeder V-Kanal verwendet werden, müssen mit einer Pasteurpipette gespült werden, um jede Luftblase gebildet zu beseitigen.
- Dann wurden 100 ul von 10 M NH 4-Acetat (zur Visualisierung erleichtert eine kleine Menge von Bromphenolblau hinzugefügt wird, gerade genug, um es Farbe) werden sanft in die V-Kanal hinzugefügt.
- Der Deckel sollte sanft geschlossen werden keine Aufwirbelung des hohen Salz-Kissen zu verhindern.
- Elektroelution ist bei 100 Volt für 25 Minuten begonnen.
- Wenn electrolution abgeschlossen ist, werden 400 ul von V-Kanal entfernt, und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 2 Volumina kaltem Ethanol und Glykogen (empfohlen DNA-Ausbeute zu erhöhen) bei 4 ° C für 1 Stunde oder über Nacht ausgefällt werden.
- Zentrifuge für 20 Minuten, entfernen Sie den Überstand und wäscht mit 70% Ethanol.
- Dry Rohr und Quantifizierung der DNA bei OD 260 nm.
- Die Erholung erhalten wurde, 75% (63 ng erholt Wenn 84 ng auf dem V-Kanal gelegt wurden).
Abbildung 1. Electroeluter Diagramm. Anod ein Kathode auf jeder Seite des Tanks, DNA im Gel geschnitten enthalten sind, angegeben (dargestellt als ein schwarzes Quadrat) wird in Richtung Kathode durch ihre negative Ladung zu migrieren. Dann wird es in das Salz Kissen (dargestellt als ein umgekehrtes schwarzes Dreieck) in der V-Kanal befindet sich gefangen zu sein.
Discussion
Die Dauer des Laufs wird in hohem Maße abhängig von der Größe der Fragmente, die normalerweise für Fragmente bis zu 20 kb 50 Minuten bis 1 Stunde ist genug, während für kleine Fragmente UV-Licht Überwachung alle 10 Minuten ist erforderlich, um das Fragment zu verhindern, um durch die go Salz Kissen und damit auf die anodische Pufferkammer abnehmender Erholung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass, wenn Sie Ihr Netzteil, eingestellt auf 100 Volt, gibt es eine aktuelle mindestens von 10 MAMP. Die DNA-Bande kann durch Verwendung eines UV-Handlampe überwacht werden und erkennen, wenn diese verlässt das Gel in Scheiben schneiden. Das Polster Salz kann auch mit 3 M Na-Acetat werden.
Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA oder RNA-Fragmente unterschiedlicher Größe mit einer guten Erholung (~ 80%) auf radioaktiv werden, verdaut durch Restriktionsenzyme, verarbeitet durch modifizierende Enzyme, etc.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit in Dr. Bermudez Labor wurde von CONACYT (Grant # 82622) gefördert. Wir danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez und Ximena Rodriguez-Torres für die Videoaufzeichnung der electroleution Verfahren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
