Summary
Новый хозяин факторов, связанных с вирусной инфекцией, могут быть идентифицированы с помощью клеточной генома потери функция экранирования RNAi.
Abstract
Вирусные возбудители представляют собой значительную опасность для здоровья; может не только вирусы вызывают естественный эпидемий болезней человека, но и их потенциальное использование в биотерроризма также вызывает озабоченность. Лучшее понимание клеточных факторов, которые влияют инфекции будет способствовать развитие столь необходимой терапии. Последние достижения в области РНК-интерференция (RNAi) технологии в сочетании с полным секвенирование генома нескольких организмов привело к оптимизации генома, клеточной потерей функции экранов. Дрозофилы клетки являются особенно поддаются генома масштаба экраны из-за простоту и эффективность RNAi в этой системе 1. Важно отметить, что разнообразные вирусы могут инфицировать клетки дрозофилы, в том числе ряда млекопитающих вирусами медицинского и сельскохозяйственного значения 2,3,4. Предыдущая экранах RNAi у дрозофилы определили факторы хозяина, которые требуются для различных шагов в вирусной инфекции, включая вступление, перевод и РНК, репликация 5. Более того, многие клеточные факторы, необходимые для репликации вируса в культуре клеток дрозофилы также ограничивающий в клетках человека, инфицированных этими вирусами 4,6,7,8, 9. Таким образом, идентификация факторов хозяина кооптированы во время вирусной инфекции представляет новых целей для противовирусной терапии. Здесь мы представляем обобщенные протокол для высокой пропускной RNAi экран для выявления клеточных факторов, участвующих в вирусной инфекцией, используя вирус коровьей оспы в качестве примера.
Protocol
Часть 1: RNAi в 384 луночных
- Стандартизация реагентов, используемых для скрининга является существенным. Мы проверяем отдельным партиям СМИ Шнайдера, эмбриональной телячьей сыворотки, и окрашивания реагентов. Тогда мы аликвоту и использовать тот же многое для всего экрана.
- Для любого анализа, то лучше проверить несколько различных клеточных линий, чтобы определить, какие наиболее поддаются ваши биологические считывания. Обычно мы используем S2-д.т.н. линии.
- Расти дрозофилы клетки при 25 ° С в средствах массовой информации полный Шнайдера.
- Шнайдера СМИ
- 10% тепла инактивированной FBS
- 1X L-глютамин
- 1X Pen / стрептококк антибиотиков
- Дрозофилы клетки являются полу-сторонника и пассировать без трипсинизации каждые четыре дня с помощью пипетки клетки с колбами и разбавления клетки 1:10 в свежем колбу. Клетки должны быть в лог-фазе для экспериментов.
- Пластины к пластине и изо дня в день изменчивости сведены к минимуму за счет использования автоматизированных наливных для всех жидких дополнений в мульти-луночных планшетах. Мы используем WellMate (Matrix).
- Подготовка WellMate труб.
- Спрей капот и WellMate с 70% этанола.
- Удалите трубку от упаковки и спрей с 70% этанола.
- Вставьте кассету в трубку выдачи позицию по WellMate.
- Премьер трубка с 25 мл 70% этанола.
- Стерилизовать трубы в этаноле в течение 15 минут, после чего премьер с еще 25 мл этанола.
- Промойте трубы от грунтовки с 50 мл стерильного PBS.
- Выбить клетки из колбы и считать. Гранул клеток так, что у вас есть 25% больше, чем нужно (300xg, 5 мин). Число клеток посеяны на скважину должны быть оптимизированы в соответствии с анализа длины. При проведении автоматизированного анализа изображения, одного монослоя, без комков ячейка идеально подходит для сегментации изображения.
- Ресуспендируют гранулированных клеток сыворотки среде Шнайдера на 1.7x10 6 клеток / мл.
- Мы выполняем экрана в 384 луночных предварительно аликвоты с коммерчески доступные библиотеки дсРНК в концентрации 250ng/well. Несколько скважин каждой пластины остаются пустыми для элементов управления, которые добавляются вручную. Мы используем дсРНК для люциферазы в качестве отрицательного контроля. Мы используем дсРНК против тема (ДиПД) в качестве контроля для надежной RNAi. Уложи этого антиапоптотического фактор приводит к драматической гибели клеток и быстрый визуальный способ оценить качество сбить. Наконец, мы используем дсРНК против вирусного репортера, в данном случае бета-galacosidase, в качестве положительного контроля для подтверждения того, что мы можем подавлять вирусную инфекцию с помощью нашего анализа считывания. Если кровянистые выделения дсРНК в пластине в момент клетка посева, аликвоту 1 мкл дсРНК в угол и для упрощения визуализации, то центрифуги дсРНК на нижней части скважины (300xg, 1 мин) перед добавлением клеток.
- Используйте WellMate добавить 10 мкл клетки полученного ранее в каждую лунку.
- Спиновые клеток на пластинах путем центрифугирования 300xg, 1 мин.
- Инкубируйте в 25 ° C инкубаторе в течение 45 минут.
- Добавьте 20 мкл полный СМИ Шнайдера и центрифуги 300xg, 1 мин.
- Место пластин в увлажненные контейнеры Tupperware выстроились с водянистыми бумажные полотенца. Объем 384 также мала, таким образом, испарение может иметь большое влияние на биологию, которая в свою очередь может привести к искусственной изменения в чтение выходы края скважин. Чтобы преодолеть это, плиты должны быть сохранены в условиях высокой влажности.
- Инкубируйте в течение трех дней, чтобы обеспечить надежную нокдаун. Существует не нужно менять носитель или открытых увлажненных контейнеров в это время.
Часть 2: Заражение с вирус коровьей оспы
- Стерилизовать многоканальный аспиратор в Quatricide в течение 15 минут, затем промыть в 70% этанола.
- Подготовка WellMate как описано выше.
- Подготовка медиа Шнайдера с 2% ЭТС-инфекции путем разбавления полный медиа 1:5 в сыворотке свободных средств массовой информации.
- Фильтры сырой запас вируса через шприц 0,8 мкм фильтр для удаления клеточных остатков или использования очищенного вируса.
- Развести вирус коровьей оспы в 2% СМИ сыворотке Шнайдера получить множественность заражения (МВД) 2.
- Удалить из PBS WellMate труб, и премьер-разбавленным вирус, пока трубка не содержит пузырьков воздуха.
- Используйте стерилизованные многоканальный аспиратор и вакуумный коллектор, чтобы мягко удалить средств массовой информации из пластин дсРНК-обработанных клеток дрозофилы.
- Внесите 30 мкл вируса на одну скважину на тарелки использованием WellMate.
- Центрифуга пластин 1 минуту при 300xg.
- Стерилизовать WellMate труб. Премьер с 25 мл 10% Блеяч, подождите 10 минут, и премьер-с еще 25 мл 10% гипохлоритом натрия.
- Премьер трубка с 50 мл воды, а затем на 50 мл 70% этанола. Вернуться трубку к его упаковке.
- Вернуться пластин увлажненной контейнере Tupperware. Инкубировать при 25 ° С в течение 48 часов.
Часть 3: Окрашивание Плиты
- Fix пластин в 15 мкл 4% формальдегида / PBS в течение 10 минут. Жидкость удаляется с помощью многоканального аспиратор и вакуумного многообразия на каждом шагу. Как только пластины были исправлены, стерильные оборудование и реактивы больше нет необходимости.
- Удалить фиксировать и использовать WellMate добавить 30 мкл PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Инкубируйте 10 минут и повторите упражнение. Эксплуатация WellMate, как описано выше, за исключением трубы не должны быть стерилизованы.
- Для обнаружения инфекции вакцины мы используем β-галактозидазы репортер обусловлен ранний / поздний промотор вакцины.
- Удалите жидкость и инкубировать клетки в блоке (PBST с 2% BSA) в течение 10 минут.
- Развести первичных антител в блок, удалить жидкость и добавить 15 мкл антител в каждую лунку использовании многоканальных повторить пипетки (Matrix).
- Спином вниз пластин (300xg, 1 мин), накрыть ясно стикер, и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.
- Удаление первичного антитела, а также использовать WellMate мыть скважин в PBST 3 раза по 10 минут.
- Развести флуоресцентно меченых вторичных антител (FITC) и ядерных пятном в блок, и добавить 15 мкл для скважин с помощью многоканальной пипетки повторить.
- Инкубируйте пластин 1 час при комнатной температуре в защищенном от света месте.
- Вымойте скважин в PBST 3 раза по 10 минут использования WellMate.
- Печать пластины с четко наклейку, накройте крышкой и хранить при 4 ° С до трех недель.
Часть 4: Работа с изображениями и анализ изображений
- Использование автоматизированного микроскопа при 20-кратным увеличением изображения на пластинах.
- Захват изображений от общего числа ядер (DAPI) и инфицированных клеток (FITC). Оптимизация времени экспозиции для каждого канала в отдельности, чтобы максимизировать динамический диапазон.
- Тонкая настройка функции автоматического фокуса, принимая стек Z изображений, расположенных 1 мкм друг от друга, которые охватывают самолеты выше и ниже ожидаемого плоскости фокуса. После оптимальной фокальной плоскости находится, регулировать настройки автофокуса соответственно.
- Изображение всей пластинки, захватив не менее трех изображений в хорошо в обоих Hoechst канал (DAPI) и вирус канал (FITC). Выберите сайты из разных регионов внутри одной скважины с целью захвата изображения, которые представляют также целого.
- Используйте MetaXpress программное обеспечение для записи журнала в сегменте изображения и использовать модули ядра графа для расчета общего количества клеток положительные для ядерных окрашивания (всего клеток) и инфекции (FITC) для каждой пластины.
- Рассчитать процент инфекции (100 * FITC положительный / общего числа клеток) и журнал преобразования.
- Чтобы определить кандидатов мы используем надежные оценка Z основываться на средней и межквартильный размах каждой пластины. Этот метод не чувствителен к выбросам и несимметричные данных, и таким образом обеспечивает большую мощность в определении даже слабые или умеренные хитов 10. Для каждой пластины, среднее вычитается из лог-преобразованных данных. Затем полученные значения делятся на 0,74 раза межквартильный диапазон (разница между значениями 75-й процентили и 25-й процентиль). 0,74 фактор используется для аппроксимации стандартное нормальное распределение.
- Надежная оценка Z является мерой расстояния в стандартных отклонений от медианы пластины. Например, надежная Z-2 балла указывает% заражение также составляет ~ 2 стандартных отклонения от средней пластины или р <0,05.
- Анализ количества клеток для выявления цитотоксических кандидатов. Рассчитать надежная оценка Z ядерного рассчитывает. Кандидаты с надежной Z <-2 в двух экземплярах экраны считаются цитотоксическими.
- Уэллс, которые имеют надежные оценка Z на процент заражения> 2 или <-2 в двух экземплярах, экраны (р <0,0025) без цитотоксичности считаются потенциальными кандидатами от основного экрана.
- Положительный кандидатов проверяются с использованием независимых реагентов. dsRNAs генерируются против генов интерес из другого региона мРНК и протестированы как указано выше.
- Те гены, для которых два независимых dsRNAs имеют одинаковый фенотип может рассматриваться для дальнейшего изучения.
Часть 5: Представитель Изображения и интерпретация инфекции
Рисунок 1. Неинфицированные скважин не показывают окрашивание на белки вируса коровьей оспы, а также представитель инфицированных содержит клетки окрашивания положительным для вакцинного выраженного бета-галактозидазы (βgal) белка, измеренная с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.Вирус = зеленый, синий = ядер.
Рисунок 2. Автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений количественно инфекции у каждого изображения, используя параметры, заданные пользователем. В представителю изображения, общее количество клеточных ядер и число клеток, экспрессирующих антиген вирусного подсчитываются в зависимости от размера и интенсивности окрашивания выше локального окрашивания фона.
Рисунок 3. Нокдаун нити (ДиПД) выступает в качестве положительного контроля для надежного разрушения РНК-интерференции генов-мишеней. Нокдаун этого антиапоптотического фактора приводит к драматической гибели клеток. Ядер = синий.
Рисунок 4. Нокдаун люциферазы служит в качестве отрицательного контроля за влияние двухцепочечной РНК лечение инфекции. Истощение люциферазы не влияет на инфекции по сравнению с клетками не лечить. Вирус = зеленый, синий = ядер.
Рисунок 5. Нокдаун βgal белок служит в качестве положительного контроля для сокращения инфекции, так как анализ использует βgal белка, как зачитал инфекции. Истощение βgal приводит к уменьшению доли инфицированных клеток. Вирус = зеленый, синий = ядер.
Рисунок 6. Нокдаун клеточных факторов Rab5 приводит к уменьшению доли инфицированных клеток. С Rab5, как известно, участвуют в эндоцитоз, вероятно, этот фактор вносит свой вклад в запись вируса коровьей оспы. Это представляет пример выброс с экрана. Вирус = зеленый, синий = ядер.
Discussion
Генома РНК-интерференции скрининга у дрозофилы обеспечивает надежный и эффективный метод для изучения клеточных компонентов вирусной инфекции. Число млекопитающих вирусы заражают дрозофилы клетки, которые могут быть использованы для идентификации компонентов хост внутренней иммунный ответ, и хозяин белковые факторы, необходимые для репликации вируса, которые могут представлять новые терапевтические мишени. Перед выполнением экран, анализа должны быть тщательно оптимизирован для типа клеток, число клеток, а также инфицирование уровне, и должны быть хорошо контролируется, в том числе и положительные, и отрицательные вирусных и клеточных мишеней 11. Важно, чтобы обеспечить достаточное расстояние между положительным и отрицательным контролем до скрининга, чтобы максимизировать динамический диапазон анализа. Как только на экране была выполнена, кандидатов можно разделить на функциональные категории, чтобы определить, какой хост механизмы способствуют инфекции. Для млекопитающих вирусы, такие как вакцины, вклад млекопитающих гомологов по RNAi должна быть определена в рамках вторичного анализа. Взятые вместе, эти надежные методы скрининга позволят нам разобраться в комплексе механизмов, посредством которых вирусы взаимодействуют с клетками-хозяевами.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIAID (R01AI074951, U54AI057168) и Пенн Геном границ Института SC, из NIH T32HG000046 к TSM, от NIH T32GM07229 и T32AI007324 для LRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).
- Chotkowski, H. L. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication. J Virol. 62, 277-284 (1988).
- Sessions, O. M. Discovery of insect and human dengue virus host factors. Nature. 458, 1047-1050 (2009).
- Cherry, S. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions? Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).
- Hao, L. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Cherry, S. COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).
- Cherry, S. Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition. Genes Dev. 19, 445-452 (2005).
- Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).
