Summary
هنا نقدم الحقن داخل القحف ناقلات AAV لوصفها الفلورسنت من الخلايا العصبية والدبقية في القشرة البصرية.
Abstract
الحقن داخل القحف ناقلات فيروسية هندسيا للتعبير عن بروتين فلوري هو أسلوب متعدد الأغراض لوسم التصور من مجموعات فرعية معينة من الخلايا في مناطق الدماغ المختلفة سواء في الجسم الحي وأقسام الدماغ. خلافا لحقن الأصباغ الفلورية ، ووضع العلامات الفيروسية عروض استهداف أنواع الخلايا الفردية وأقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا من إنشاء خطوط الفأر المعدل وراثيا. في هذه التقنية ، يتم حقن الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) المتجه باستخدام إحداثيات intracranially التجسيمي ، micropipette ألف ومضخة آلية لتسليم الدقيق للAAV إلى المنطقة المرجوة بأقل ضرر في الأنسجة المحيطة. ويمكن تكييف المعلمات حقن للتجارب الفردية من خلال تعديل سن الحيوانية بمعدل الحقن ، موقع الحقن ، وحجم الحقن ، الحقن ، والمصلي AAV المروج القيادة التعبير الجيني. تبعا للظروف المختار ، يمكن فيروسي بفعل التحوير التعبير التصور تسمح لمجموعات من الخلايا ، والخلايا الفردية أو العمليات الخلوية الجميلة ، وصولا الى مستوى العمود الفقري شجيري. أظهرت التجربة هنا يصور حقنة من المزدوج تقطعت بهم السبل AAV معربا عن بروتين الفلورية الخضراء لوضع العلامات على الخلايا العصبية والدبقية في القشرة البصرية الأولية الماوس.
Protocol
1. التعامل مع الفيروس والتخزين
- وينبغي اختيار الحماية المناسبة وتقنيات معالجة استنادا إلى مستوى السلامة البيولوجية للفيروس لاستخدامها. يمكن العثور على هذه الممارسات في مجال السلامة في المختبرات الميكروبيولوجية والحيوية الطبعة 5 ، متوفرة على موقع مركز السيطرة على الأمراض
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). تمت الموافقة على استخدام ناقلات AAV لمستوى السلامة الأحيائية 1 (BSL - 1). للتجربة هو موضح هنا ، سيتم ارتداء معطف المختبر والقفازات عند التعامل مع الفيروس ، وفقا للإجراءات للتعامل مع BSL - 1 الوكلاء. - للحفاظ على نشاط الفيروس فمن الأفضل لتقسيمه إلى aliquots صغيرة لتجنب تكرار تجميد والذوبان.
- يعد مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (BSC) من الدرجة الثانية لaliquoting الفيروس بمسح ش أي كائنات لا لزوم لها وتعقيم السطح مع EtOH 70 ٪. دورق مكان تحتوي على 10 ٪ من محلول التبييض في غطاء محرك السيارة لجمع النفايات الملوثة AAV. كما وضعت في BSC 0.5mL هي أنابيب معقمة وعاء من الثلج الجاف.
- ذوبان الجليد على الأسهم الفيروسية خارج ش.
- دوامة الفيروسات وفتح أنبوب داخل ش.
- ماصة حجم قسامة المطلوب (مثلا 5 ميكرولتر) في أنبوب 0.5mL ، أغلق أنبوب ووضعه في الجليد الجاف لفلاش تجميد الفيروس.
- عندما تم aliquoted عن الفيروس ، والتخلص من الفيروس وأنبوب نصائح ماصة في حاوية النفايات المحتوية على مواد التبييض 10 ٪.
- إزالة النفايات من الحاويات غطاء المحرك وإضافة إضافية التبييض 10 ٪ ، ثم صب التبييض اسفل الحوض. التخلص من النفايات في حاوية بلاستيكية واقية وفقا للتعليمات التي كتبها ضابط السلامة الأحيائية المعهد الخاص بك.
- تنظيف أي معدات أو الأسطح التي جاءت في اتصال مع الفيروس مع التبييض 10 ٪. تجاهل قفازات.
- aliquots تخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية.
2. جراحة
- تغطية المنطقة الجراحية مع معمل ورق ماص مقاعد البدلاء. ويجب تعقيم الأدوات الجراحية وفعل الجراحة تحت ظروف معقمة وفقا للسلامة الأحيائية مؤسستكم والمبادئ التوجيهية استخدام الحيوانات.
- اختيار المنطقة المتاخمة لمنطقة العمليات الجراحية التي ستكون مخصصة لتحميل micropipettes مع الفيروس ، والغطاء مع ورقة ماصة المختبر مقاعد البدلاء. وضع علامة قسامة من الفيروس في وعاء يحتوي على الجليد في هذا المجال ، ويسمح للفيروس ذوبان الجليد على ما يجري عملية جراحية.
- إعداد حاوية النفايات من المبيض بنسبة 10 ٪ في مجال التعامل مع فيروس مخصص للتخلص من نصائح ماصة الخ ، والتي تأتي في اتصال مع الفيروس.
- سحب micropipette Wiretrol الزجاج ليبلغ قطرها حوالي غيض من 20 ميكرون. وضع قطرة صغيرة من الزيوت المعدنية في نهاية حادة لmicropipette وإدراج المكبس السلك المتوفرة مع micropipettes.
- تأمين micropipette في المشبك الذراع micropump.
- حقن تحت الجلد مع ماوس البوبرينورفين بجرعة 0.5 ملغ / كلغ. الفأر مع تخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق آفيرتين مع جرعة من 200 ملغ / كغ وإزالة الشعر من أعلى الرأس مع مقص جراحي ، مع التأكد من ترك هوامش واسعة بما يكفي لمنع الشعر من دخول شق.
- نعلق بطانية التدفئة الى قاعدة لstereotax للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية طوال الجراحة وتأمين الماوس في stereotax.
- الاستحمام في الرأس مع ثلاثة الدعك بالتناوب من الإيثانول وbetadine لتعقيم المنطقة.
- وضع قطرة العين مرهم Tobradex على كل عين لإبقاء العينين رطبة أثناء الجراحة.
- إجراء شق أسفل خط الوسط من الرأس وسحب الجلد مرة أخرى لفضح الجمجمة.
- إزالة بعناية لفافة من الجمجمة باستخدام غرامة ذات الرؤوس ملقط.
- تحديد المنطقة المراد حقنها باستخدام الإحداثيات التجسيمي وعلامة الجمجمة بالقلم الجراحية.
- باستخدام حفر الأسنان مع 1.4mm لدغ ، رقيقة من المنطقة عن والجمجمة حوالي 2mm وقطرها حتى الشقوق في الجمجمة ، وتقسيم المنطقة إلى قطاعات عدة ضعيفة.
- طوال هذا الإجراء ، والحفاظ على الجمجمة رطبة مع تطبيقات المالحة عقيمة.
- أداء حج القحف عن طريق إزالة بلطف شرائح رقيقة باستخدام جمجمة خارج غرامة يميل ملقط.
3. تحضير الحقن
- مع KimWipe توضع فوق الغطاء ، وفتح أنبوب 1.5uL الفيروس وماصة (لحقن 1uL) من الفيروس على قطعة صغيرة من parafilm.
- مكان غيض من micropipette في الأسهم الفيروسية وسحب الغواص يدويا. إذا واجهت صعوبة الرسم الأسهم الفيروسية في micropipette ، يمكن توسيع غيض قليلا تكون خارقة a KimWipe مع micropipette لكسر جزء صغير من الزجاج.
- وبدد انخفاض ذراع micropump على المكبس حتى كمية صغيرة من الفيروس من غيض من micropipette. إزالة هذه قطرة صغيرة من القطن مع قضيب طرف قضيب وتجاهل في جملته الحاويات.
- تطبيق قطرة من الزيوت المعدنية لغيض من micropipette لمنع انسداد كما خفضت micropipette في الدماغ.
4. حقن الفيروس
- باستخدام إحداثيات X و Y التجسيمي ، موقف micropipette على المنطقة المراد حقنها. في هذه التجربة ، وينسق استخدام التجسيمي لتحديد القشرة البصرية الأولية الخلفي ل2.7mm 2.5mm bregma والوحشي على خط الوسط. انخفاض ببطء جدا micropipette (بمعدل تقريبي من 1mm/1minute) لمنصب Z المناسبة.
- أدخل المعلمات الحقن المطلوب في مربع Micro4 SYS تحكم micropump والشروع في عملية الحقن. عن هذه التجربة ، سيتم استخدام 1 ميكروليتر أكثر من 10 دقيقة كنسبة من الحقن.
- عند الانتهاء من الحقن ، وترك الباقي للماصة ل1-2 دقائق لمنع هروب رأس المال من خلال إزالة الفيروس. بعد هذه الفترة ، وإزالة جدا ببطء micropipette من الدماغ (بنفس المعدل على النحو الوارد أعلاه).
- الدرز فروة الرأس وختم ذلك مع الغراء الأنسجة. حقن تحت الجلد مع الحيوان البوبرينورفين بجرعة 0.1 ملغ / كغ كل 8-12 ساعة على مدى ال 72 ساعة القادمة ، أو طالما أن الحيوان هو اظهار علامات الألم. السماح للحيوان لاسترداد تحت مصباح الحرارة حتى يتم التجول وعلى استعداد ليكون عاد الى قفصه. ويمكن البدء في تجارب التصوير بعد فترة حضانة المطلوب (أيام إلى أسابيع بعد الحقن الفيروسية).
5. تنظيف
- شطف micropipette مع التبييض 10 ٪ وتخلص منه في حاوية الحادة.
- التخلص من النفايات في حاوية بنفس الطريقة القسم 1.
- تجاهل معمل الورق في مقاعد البدلاء بن بيولوجية ويمسح أسفل جميع الأسطح والأدوات التي قد تأتي في اتصال مع الفيروس مع التبييض 10 ٪.
- يجوز تجميد الفيروس المستخدمة مرة أخرى ، مع الأخذ في الاعتبار أن تتكرر تجميد / الذوبان دورات يسبب تدهور للفيروس.
6. ممثل النتائج
Transduced الشكل 1. عصبون بعد الحقن المزدوج تقطعت بهم السبل المصلي الفيروس الغدة المرتبطة 1 (dsAAV S1) تحمل بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة promotor CMV. تصوير خلايا الجسم فضلا عن التشعبات والداني القاصي مرئية بشكل واضح في الأبواب الثابتة باستخدام المجهر epifluorescent. مقياس بار = 100 ميكرومتر.
الشكل 2. صفها نموذجي لحقن الفيروس داخل القحف في القشرة البصرية الأولية باستخدام S1 dsAAV تبين مدى انتشار الفيروس وكذلك الخلايا العصبية المسماة ، الدبقية والعمليات. مقياس بار = 250 ميكرومتر.
الشكل 3. صفها من الخلايا في قرن آمون باستخدام dsAAV S1. مقياس بار = 250 ميكرومتر. تتكيف هذه الأرقام من لوري وآخرون 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فيروسي بوساطة توصيل الجينات يحمل إمكانات كبيرة لدراسة العمليات العصبية وعلاج اضطرابات الدماغ 1،2،3. ويمكن أيضا للتنوع كبير من هذه التقنية يمكن استغلالها لتسمية الخلايا fluorescently التصوير على حد سواء في المختبر والمجراة 4. نحن هنا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لتنبيغ الخلايا العصبية والدبقية في القشرة البصرية باستخدام الماوس مزدوج الجديلة الغدة معربا عن تعزيز ارتباط الفيروس بروتين الفلورية الخضراء.
في حين أن هذا الأسلوب هو نسبيا على التوالي إلى الأمام ، وهناك عدد من التفاصيل التقنية التي تحتاج إلى النظر فيها. أحد العوامل الهامة التي يسببها الحقن تلف الأنسجة -- وبالتالي لا بد من استخدام قدر كبير من الحذر خلال الجراحة والإدراج / إزالة micropipette. ويمكن لعملية جراحية نتيجة فشل في تغيير هياكل ليمكن تصوير. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تحميل الفيروس في micropipette ، يجب توخي الحذر الشديد لمسح أي فقاعات هواء في طرف ، وضمان ماصة يتم حقن حجم المناسبة. خفض micropipette قليلا بعد الهدف Z - تنسيق ثم يمكن سحبه إلى الموضع الصحيح منع الفيروس من تفيض من موقع الحقن. وينبغي عند اختيار وقت الحضانة ، والسماح يعتبر وقتا كافيا للتعبير الجين الفيروسي. هذا وسوف تختلف بناء على الفيروس المستخدمة. قد تكون هناك استجابة محدودة المناعة التي تسببها الحقن. في تجربتنا ، ويقتصر عموما هذا الالتهاب إلى مسار الإبرة ، ويمكن تجنبها عن طريق التصوير بعيدا عن مرأى الحقن (ما يقرب من 50 μms أو أكثر). أخيرا ، إذا أقسام الدماغ هي لتركيبها على الشرائح ، واستخدام وسيلة antifade التركيب المقترح للحفاظ على مضان.
الحقن داخل القحف النواقل الفيروسية والمزايا التقنية على مدى عدة تقنيات وضع العلامات الأخرى. من خلال استخدام إحداثيات التجسيمي وتحوير حجم حقن ، ويمكن تسمية الفلورسنت المترجمة بالتحديد إلى منطقة المصالح. ويمكن تغيير مقدار التنبيغ عن طريق ضبط حجم حقن ، وعيار الفيروس أو بقاء الوقت ، مما يتيح لرؤية أي من مجموعات من الخلايا أو الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام انواع مختلفة من الفيروسات (مثل فيروس الهربس الفيروسة البطيئة ، اتش) تعدل أيضا توقيت وكمية البروتين الفلوري أعرب فضلا عن أنواع الخلايا المستهدفة. عموما ، يمكن أن توفر هذه التقنية لوضع العلامات متنوعة جدا من عناصر مختلفة لتصوير الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وتمت الموافقة على البروتوكولات الحيوانية والتجريبية من جامعة روتشستر جامعة جنة الموارد الحيوانية (UCAR) وفقا لسياسة رعاية PHS الرفق بالحيوان واستخدام الحيوانات المختبرية.
Acknowledgments
وقدم هذا العمل ممكن من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY012977) ، وجائزة شهادة في العلوم الطبية الحيوية من صندوق ويلكوم بوروز ، ومؤسسة وايتهول ، ومؤسسة سلون (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
