Summary
Здесь мы представляем внутричерепное введение вектора AAV для флуоресцентной маркировки нейронов и глии в зрительной коре.
Abstract
Внутричерепное инъекции вирусных векторов спроектирован, чтобы выразить флуоресцентный белок является универсальный метод маркировки для визуализации конкретных подмножеств клеток в разных областях мозга, как в естественных условиях и в мозгу разделов. В отличие от введения флуоресцентных красителей, вирусные маркировки предлагает нападения на отдельных типов клеток и является менее дорогостоящим и трудоемким, чем создание трансгенных линий мышей. В этой технике, адено-ассоциированные вирусные (AAV) вектор вводится интракраниально использованием стереотаксической координаты, микропипетки и автоматизированные насос для точной доставки AAV в нужную область с минимальным повреждением окружающих тканей. Инъекция параметры могут быть адаптированы для отдельных экспериментов, регулируя животных возрастом в месте инъекции, инъекции место, объем впрыска, скорость впрыска, AAV серотипа и промоутер вождения экспрессии генов. В зависимости от выбранных условиях, вирусно-индуцированной экспрессии трансгена может позволить визуализации группы клеток, отдельные клетки или тонкого клеточные процессы, вплоть до уровня дендритных шипиков. Эксперимент показал здесь изображен инъекции двухцепочечной AAV выражения зеленого флуоресцентного белка для маркировки нейронов и глии в мышь первичной зрительной коры.
Protocol
1. Обработка от вирусов и хранения
- Правильная защита и методов обработки следует выбирать в зависимости от уровня биобезопасности вирус, который будет использоваться. Эти практики могут быть найдены в Биобезопасность в микробиологических и биомедицинских лабораторий 5-е издание, на сайте CDC
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Использование векторов ААВ, предназначен для биобезопасности Уровень 1 (BSL-1). Для эксперимента показано здесь, халат и перчатки будут носить при работе с вирусом, в соответствии с процедурами обработки BSL-1 агентов. - Для сохранения активности вируса лучше всего разделить его на небольшие порции, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания.
- Подготовка биобезопасности кабинета (BSC) Второй сорт для aliquoting вирус, очистив BSC любых ненужных объектов и стерилизации поверхность с 70% этанола. Место стакан, содержащий 10% раствор хлорки в капюшоне для сбора AAV-загрязненных отходов. Также размещены в BSC стерильны 0,5 мл труб и контейнеров сухого льда.
- Оттепель вирусные акции на льду за пределами BSC.
- Вирус Vortex и открытой трубки внутри BSC.
- Внесите желаемые аликвоту объема (например, 5 мкл) в 0,5 мл трубки, закройте трубки и поместить его в сухой лед, чтобы заморозить флэш-вирус.
- Когда все вирус был аликвоты, распоряжаться трубки вирусов и наконечники в контейнер для отходов, содержащих 10% гипохлоритом натрия.
- Удалить контейнер для отходов с капюшоном и добавить дополнительные 10% гипохлоритом натрия, а затем залить отбеливателем в раковину. Утилизация пластиковых отходов в контейнер для биологически опасных в соответствии с инструкциями по биобезопасности офицер вашего института.
- Очистите оборудование или поверхности, которые были в контакте с вирусом с 10% отбеливателя. Отменить перчатки.
- Магазин аликвоты в морозильной камере -80 ° C.
2. Хирургия
- Обложка хирургической области с фильтровальной бумагой скамейке лаборатории. Хирургические инструменты должны быть стерилизованы и хирургии сделано в асептических условиях в соответствии с биологической безопасности вашей организации и руководящие принципы использования животных.
- Выбор территории, прилегающей к хирургической области, которая будет посвящена загрузке микропипетки с вирусом, и покрыть ее впитывающей бумагой скамейке лаборатории. Место аликвоты вируса в контейнер льда в этой области и позволяют вирусу оттепели на льду, операция может быть исполнено.
- Установка контейнер для отходов на 10% отбеливателя в выделенной области обработки вирус для утилизации наконечники для пипеток и т.д., которые вступают в контакт с вирусом.
- Вытяните микропипетки стекла Wiretrol на наконечник диаметром около 20 микрон. Место небольшую каплю минерального масла на тупой конец микропипетки и вставьте провод поршень снабжен микропипетки.
- Безопасные микропипетки в зажиме микронасоса руку.
- Inject мыши подкожно бупренорфина в дозе 0,5 мг / кг. Обезболить мышь с Avertin через введении препарата в дозе 200 мг / кг и удалить волосы с верхней части головы с хирургическими ножницами, убедившись, что оставляют поля достаточно большой, чтобы предотвратить попадание волос разрез.
- Прикрепить отопления одеяло на базу stereotax для поддержания температуры тела 37 ° С в течение операции и безопасной мыши в stereotax.
- Купайтесь головой с тремя переменного скрабы этанола и бетадин для стерилизации области.
- Место капли глазная мазь Tobradex на каждый глаз, чтобы сохранить глаза влажными во время операции.
- Сделать разрез вдоль средней линии головы и потяните кожу назад подвергать черепа.
- Осторожно снимите фасции из черепа использовании с острым концом щипцов.
- Найдите площадь для инъекций использованием стереотаксической координаты и отметка череп с хирургической ручкой.
- Использование бормашины с 1,4 мм заусенцев, тонкая область черепа примерно 2 мм в диаметре, пока трещины черепа, разделив разбавленной области на несколько сегментов.
- В этой процедуре, держать влажную черепа с приложениями стерильного физиологического раствора.
- Выполните трепанации черепа, осторожно удаляя разбавленной черепа сегментов с помощью экстра-тонкой наконечником щипцами.
3. Подготовка инъекций
- С KimWipe находиться над крышкой, открытая труба от вирусов и пипетки 1.5uL (для 1UL инъекций) вируса на небольшой кусочек парафильмом.
- Место кончике микропипетки в вирусные акции и вручную снять поршень. Если Вы испытываете трудности рисования вирусных акций в микропипетки, кончик может быть увеличена незначительно быть пирсинг KimWipe с микропипетки разбить небольшую часть стекла.
- Нижняя микронасос руку на поршень, пока небольшие количества вируса рассеивается от кончика микропипетки. Удалить эту небольшую каплю с кончика аппликатора хлопка и выбросить в аппликатор был благосклоненэлектронной контейнер.
- Применять капли нефтепродуктов до кончика микропипетки для предотвращения засорения как микропипетки опускается в мозг.
4. Вирус инъекций
- Использование X и Y стереотаксической координаты, положение микропипетки над районом, который будет введен. В этом эксперименте стереотаксической координат, используемых для обнаружения первичной зрительной коры 2,7 мм задний брегмы и 2,5 мм сбоку от средней линии. Очень медленно опустите микропипетки (по крайней скоростью примерно 1mm/1minute) в правильное положение Z.
- Введите желаемые параметры закачки в SYS Micro4 окне контроллер микронасос и начать инъекции. Для этого эксперимента, 1 мкл в течение 10 минут будет использоваться как скорость впрыска.
- При инъекции закончена, оставьте пипетку, чтобы отдохнуть на одну-две минуты, чтобы предотвратить отток вирусом во время удаления. По истечении этого срока, очень медленно удалить микропипетки от головного мозга (такой же скоростью, что и выше).
- Шовный кожи головы и запечатать его с тканью клея. Inject животным подкожно бупренорфина в дозе 0,1 мг / кг каждые 8-12 часов в течение ближайших 72 часов, или до тех пор, как животное проявляет признаки боли. Разрешить животных для восстановления под лампой тепло, пока не будет ambulating и готовы быть возвращены в свои клетки. Изображений эксперименты могут быть инициированы после желаемого инкубационный период (несколько дней или недель после вирусной инъекции).
5. Уборка
- Промыть микропипетки с 10% отбеливателя и выбросить его в контейнер острых предметов.
- Утилизировать отходы в контейнер так же, как Секция 1.
- Удалите бумагу лабораторном столе в биологической бен и протрите все поверхности и инструменты, которые могут войти в контакт с вирусом с 10% отбеливателя.
- Неиспользованные вируса могут быть заморожены снова, имея в виду, что повторный циклов замораживания / оттаивания приводит к ухудшению состояния вируса.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Трансдуцированных нейронов после введения двухцепочечной адено-связанный вирус серотипа 1 (dsAAV S1) проведение зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора CMV. Тела клетки, а также проксимальных и дистальных дендриты хорошо видны в основные разделы отображаемого использованием epifluorescent микроскопом. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 2. Маркировка типичные внутричерепное введение вируса в первичной зрительной коры использованием dsAAV S1, показывающие степень вирусного распространения, а также меченых нейронов, глии и процессов. Шкала бар = 250 мкм.
Рисунок 3. Маркировки клеток в гиппокампе использованием dsAAV S1. Шкала бар = 250 мкм. Эти цифры взяты из Лоури и соавт. 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вирусно-опосредованной доставки генов имеет большой потенциал для изучения неврологических процессов и лечения заболеваний мозга 1,2,3. Большую универсальность этой методики может быть также использована для флуоресцентно этикетке клетки для работы с изображениями, как в пробирке и в естественных 4. Здесь мы показываем, подробная процедура трансдукции нейронов и глии в мышиных зрительной коры использовании двухцепочечной адено-вирус ассоциации выразил расширенной зеленого флуоресцентного белка.
Хотя этот метод является относительно прямой вперед, Есть ряд технических деталей, которые необходимо учитывать. Одним из важных факторов является инъекция вызванных повреждением ткани - поэтому очень важно использовать большую осторожность во время операции и вставки / удаления микропипетки. Не удалось хирургия может привести к изменению структуры для включения в образ. Кроме того, после загрузки вируса в микропипетки, большое внимание должно быть принято, чтобы очистить любые воздушные пузыри на кончике пипетки и обеспечить надлежащий объем вводится. Снижение микропипетки немного за целевым Z-координат, то отказаться от нее в правильное положение может помешать вирусу переполнены из места инъекции. При выборе времени инкубации, что позволяет достаточно времени для вирусной экспрессии гена должны быть рассмотрены. Это будет меняться в зависимости от вирусов используется. Ограниченный иммунный ответ может быть вызван инъекцией. По нашему опыту, это воспаление, как правило, ограничивается иглой дорожки и можно избежать, если изображение от инъекции зрения (примерно 50 μms и более). Наконец, если мозг разделы должны быть установлены на салазках, использование antifade монтажа среду предложил сохранить флуоресценции.
Внутричерепное инъекции вирусных векторов имеет ряд технических преимуществ по сравнению с другими методами маркировки. С помощью стереотаксической координат и модулирующего объема инъекции, флуоресцентной метки могут быть точно локализованы в области интереса. Количество трансдукции может быть изменена путем изменения объема инъекции, титра вируса или выживание времени, что позволяет для визуализации или группы клеток или отдельные клетки. Кроме того, использование различных вирусов (например, лентивирус, вирус герпеса, аденовирус) также может модулировать сроки и сумму флуоресцентного белка выражено, а также типы клеток мишенью. В целом, эта техника может обеспечить очень универсальный маркировки различных элементов мозг для работы с изображениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Животного и экспериментальных протоколов были одобрены Университета Рочестерского университета Комитета по животным ресурсам (UCAR) в соответствии с PHS политики на гуманное лечение и использования лабораторных животных.
Acknowledgments
Эта работа стала возможной за счет субсидий из NIH (EY012977), Карьера премии в области биомедицинских наук от Burroughs Wellcome фонд, Фонд Уайтхолл, и Sloan Foundation (АКМ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
