Summary
Burada görsel korteks nöronlar ve glia floresan etiketlenmesi için AAV vektörleri intrakranial enjeksiyon sunuyoruz.
Abstract
İntrakranial floresan proteini ifade etmek için tasarlanmış viral vektörlerin enjeksiyonu in vivo ve beyin bölümlerde iki farklı beyin bölgelerindeki hücrelerin belirli altkümelerini görünüm için çok yönlü bir etiketleme tekniği. Enjeksiyon floresan boyaların aksine, viral etiketleme bireysel hücre tipleri hedef sunar ve transgenik fare hatları kurulması daha tüketen daha az pahalı ve zaman. Bu teknikte, adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü, çevredeki dokuya minimum zarar ile intrakranyal istenen alana stereotaksik koordinatları, bir mikropipet ve AAV hassas teslimat için otomatik bir pompa kullanarak enjekte edilir. Enjeksiyon parametreleri, enjeksiyon enjeksiyon, enjeksiyon yeri, enjeksiyon hacmi, hızı, AAV serotip ve gen ekspresyonu sürüş organizatörü hayvan yaş ayarlayarak bireysel deneyler için uygun olabilir. Seçilen koşullara bağlı olarak, viral indüklenen transgen ifadesi, dendritik dikenleri düzeyini aşağı hücreleri, tek tek hücreler veya ince hücresel süreçlerin grupları görselleştirme, izin verebilirsiniz. Burada gösterilen deneyi fare birincil görsel korteks nöronlar ve glia etiketleme için yeşil flüoresan protein ifade çift iplikli AAV bir enjeksiyon gösteriyor.
Protocol
1. Virüs İşleme ve Depolama
- Uygun koruma ve kullanım teknikleri kullanılacak virüs biyogüvenlik düzeyi dayalı seçilmelidir. Bu uygulamalar CDC web sitesinde mevcut Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlar 5 th edition, Biyogüvenlik bulunabilir
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). AAV vektörleri Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) kullanım için onaylanmıştır. Virüs işlerken deney burada gösterildiği için, bir laboratuvar önlüğü ve eldiven BSL-1 agentları için prosedürler uyarınca, aşınmış olacak. - Virüs aktivitesini korumak için tekrarlanan dondurma ve çözme önlemek için küçük alikotları içine bölmek en iyisidir.
- Biyogüvenlik Kabini (BSC) Sınıf II, herhangi bir gereksiz nesneler BSC takas ve% 70 EtOH yüzey sterilizasyon virüs aliquoting için hazırlayın. AAV-kontamine atık toplama kaputu% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir behere koyun. Ayrıca, steril 0.5mL tüpler ve kuru buz bir kap BSC yerleştirilir.
- BSC dışında buz üzerinde viral stok çözülme.
- Vorteks virüs ve BSC içinde tüp açık.
- Flaş dondurucu virüs 0.5mL bir tüp içine istenen kısım hacim (örneğin 5 mcL) Pipet, tüpün kapağı kapatılır ve kuru buz koyun.
- Tüm virüs aliquoted edildiğinde, virüs tüp ve pipet uçları,% 10 çamaşır suyu içeren atık kabını atmayın.
- Kaputun atık kabını çıkarın ve% 10 oranında ek çamaşır suyu ekleyin, daha sonra lavaboya çamaşır suyu dökün. Enstitünün biyogüvenlik memuru tarafından talimat olarak biohazard bir kap içinde plastik atık bertaraf edin.
- % 10 çamaşır suyu ile virüs ile temas geldi herhangi bir ekipman veya yüzeyleri temizleyin. Eldiven atın.
- -80 ° C derin dondurucuda saklayın alikotları.
2. Cerrahi
- Emici laboratuarlarında kağıt cerrahi alanı kapsayacak. Cerrahi aletler kurumun biyogüvenlik ve hayvan kullanım yönergelerine uygun aseptik koşullarda steril ve cerrahi yapılmalıdır.
- Mikropipetler virüs yükleme adanmış olacaktır cerrahi alanına bitişik bir alanda seçin ve emici laboratuvar tezgah kağıt ile örtün. Virüs, bu alanda buz bir kap içinde bir kısım yerleştirin ve izin ameliyat yapılmaktadır virüs buz üzerinde çözünme.
- Pipet uçları, vb. Atılmasının virüsü ile temas halinde geldiği için adanmış bir virüs taşıma alanında% 10 çamaşır suyu atık konteyneri Kur.
- Bir bardak ucu çapı yaklaşık 20 mikron Wiretrol mikropipet çekin. Mikropipet künt ucunda küçük bir damla mineral yağ koyun ve mikropipetler tel piston takın.
- Micropump kol kelepçesi mikropipet sabitleyin.
- Buprenorfin ile 0.5 mg / kg dozunda subkutan bir fare enjekte edilir. Intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 200 mg / kg dozu ile Avertin fare anestezi ve cerrahi makas ile başın üst saç kaldırmak, saç kesi girmesini engellemek için yeterince büyük marjları bırakmak emin olun.
- Vücut ısısı 37 ° C ameliyat boyunca korumak ve stereotax fare güvence altına almak için, bir stereotax taban ısıtma battaniye takın.
- Etanol ve betadin alan sterilize etmek için üç alternatif scrubs ile baş batırın.
- Ameliyat sırasında gözleri nemli tutmak için her gözün Tobradex göz merhemi bir damla yerleştirin.
- Baş orta hatta aşağı bir kesi yapın ve cilt kafatası açığa çıkarmak için geri çekin.
- Ince uçlu forseps kullanılarak kafatası fasya dikkatlice çıkarın.
- Stereotaksik koordinatları kullanılarak enjekte edilir alanını bulun ve cerrahi bir kalem ile kafatası işareti.
- Birkaç parça halinde inceltilerek alan bölme, yaklaşık 2mm kafatası kafatası çatlak kadar çapı 1.4mm bir çapak, ince bir alana sahip bir diş matkap kullanma.
- Bu işlem boyunca, steril tuzlu su uygulamaları ile kafatası nemli tutmak.
- Ekstra ince uçlu forseps kullanarak inceltilmiş kafatası parçaları hafifçe kaldırarak kraniotomi gerçekleştirin.
3. Enjeksiyon Hazırlık
- KimWipe kapağı üzerine yerleştirilen bir virüs virüs ve pipet 1.5uL (1uL bir enjeksiyon için), parafilm küçük bir parça üzerine tüp açın.
- Mikropipet ucu viral stok içine yerleştirin ve piston elle çekilmeye. Mikropipet viral stok çizim güçlük yaşıyorsanız, ucu biraz daha küçük bir bölümünü cam kırmak için mikropipet KimWipe piercing büyütülmüş olabilir.
- Mikropipet ucu kadar piston üzerine küçük bir miktar virüs Alt micropump kol effect. Idin bir pamuk uçlu aplikatör ve iptal aplikatör ile bu küçük bir damla çıkarıne kap.
- Mineral yağ mikropipet mikropipet beyin içine düşürdü olarak tıkanmasını önlemek için ucuna bir damla uygulayın.
4. Virüs Enjeksiyon
- X ve Y stereotaksik koordinatları kullanarak mikropipet, enjekte edilecek alanın üzerine yerleştirin. Bu deneyde, stereotaksik orta hatta lateral 2.7mm bregma posterior ve 2.5mm birincil görsel korteks bulmak için kullanılır koordinatları. Çok yavaş doğru Z konumuna mikropipet 1mm/1minute yaklaşık bir oranda daha düşük.
- SYS Micro4 micropump denetleyici kutuya istenilen enjeksiyon parametreleri girin ve enjeksiyon başlatabilir. Bu deney için, 10 dakika içinde 1 mikrolitrelik enjeksiyon oran olarak kullanılacaktır.
- Enjeksiyon bittiğinde, çıkarılması sırasında virüs efflux önlemek için bir-iki dakika dinlenmek için pipet bırakın. Bu dönemden sonra, çok yavaş beyin (yukarıdaki gibi aynı oranda) mikropipet çıkarın.
- Kafa derisi sütür ve doku yapıştırıcısı ile yapıştırın. Sonraki 72 saat içinde 0.1 mg / kg her 8-12 saatte bir doz hayvan buprenorfin ile subkutan enjekte edilir, veya hayvan olarak sürece ağrı belirtilerini sergiliyor. Yürüyebilen ve kendi kafesine iade edilmesi için hazır olana kadar bir ısı lambası altında hayvan kurtarmak için izin verin. Görüntüleme deneyler istenen inkübasyon süresi (viral enjeksiyondan sonra hafta gün) sonra başlanmalıdır.
5. Temizleme
- Mikropipet% 10 çamaşır suyu ile durulayın ve bir dikiş iğnesi kap içinde atın.
- Bölüm 1 aynı şekilde atık konteyneri atın.
- Laboratuarlarında kağıt biohazard bin içine atın ve tüm yüzeylerin ve aletlerin% 10 çamaşır suyu ile virüs ile temas gelmiş aşağı silin.
- Kullanılmayan virüs tekrarlanan donma / çözülme döngüsü virüs düşmesine neden olduğunu göz önünde tutarak, tekrar donmuş olabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. CMV Promotor kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) taşıyan çift iplikli adeno-ilişkili virüs serotip 1 (dsAAV S1) enjeksiyonundan sonra nöron Transduced. Epifluorescent bir mikroskop kullanılarak görüntülü yanı sıra hücre gövdesi proksimal ve distal dendritler sabit bölümlerde açıkça görülebilir. Ölçeği bar = 100 mikron.
Şekil 2. intrakranial bir virüs gibi viral yayılma derecesi etiketli nöronlar, glia ve süreçleri gösteren dsAAV S1 kullanarak birincil görsel korteks enjeksiyonu tipik Etiketleme. Ölçeği bar = 250 mm.
Şekil 3 dsAAV S1 kullanarak hipokampus hücrelerinin Etiketleme. Ölçeği bar = 250 mm. Bu rakamlar Lowery ve ark uyarlanmıştır. 2009 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viral-aracılı gen teslim nörolojik süreçleri ve beyin bozuklukları 1,2,3 tedavi çalışmaları için büyük bir potansiyele sahiptir . Bu tekniğin çok yönlülüğü de hücreleri in vitro ve in vivo 4 hem de görüntüleme için floresan etiket yararlanılabilir. Burada nöron ve gelişmiş yeşil flüoresan protein ifade eden bir çift iplikli adeno-dernek virüs kullanarak fare görsel korteks glia transdüksiyon için ayrıntılı bir prosedür ortaya koymaktadır.
Bu teknik nispeten düz ileri olmasına rağmen, dikkate alınması gereken bir dizi teknik detaylar vardır. Bir önemli faktör enjeksiyon bağlı doku hasarı, bu nedenle cerrahi ve mikropipet ekleme / kaldırma sırasında büyük bir dikkatle kullanılması çok önemlidir. Başarısız cerrahi Görüntülenecek yapılarının değişmesi neden olabilir. Ayrıca, virüs mikropipet yükledikten sonra, büyük bir özenle pipet ucu açık ve herhangi bir hava kabarcığı uygun hacim enjekte edilir sağlamak için alınması gerekir. Z-koordinat hedef biraz ötesinde mikropipet düşürülmesi sonra uygun konuma çekilerek enjeksiyon yerinde dışarı taşan virüs önleyebilirsiniz. Viral gen ekspresyonu için yeterli zaman sağlayan bir inkübasyon süresi seçerken dikkate alınmalıdır. Bu kullanılan virüs göre değişir. Sınırlı bir immün yanıt enjeksiyonu ile anlaşılabilir. Deneyimlerimize göre, bu enflamasyon genellikle iğne izlemek için sınırlı ve enjeksiyon görüş (yaklaşık 50 μms veya daha fazla) uzak görüntüleme ile önlenebilir. Son olarak, beynin bölümleri kızaklar üzerinde monte edilmek üzere iseniz, floresan korumak için önerilen bir antifade montaj orta kullanmak.
İntrakranial viral vektörlerin enjeksiyonu diğer etiketleme teknikleri üzerinde bazı teknik avantajları vardır. Stereotaksik koordinatlar ve enjekte modüle hacmi, floresan etiket kullanımı sayesinde tam bir ilgi alanı lokalize olabilir. Iletimi miktar hacim enjekte virüs titresi veya yaşam süresi ayarlayarak hücreleri veya tek tek hücreler gruplarından birinin görünüm için sağlayarak, değiştirilebilir. Ayrıca, farklı virüsler (örneğin lentivirüs, herpes virüsü, adenovirüs) kullanımı da floresan protein miktarı ve zamanlaması ifade yanı sıra, hedeflenen hücre tipleri modüle olabilir. Genel olarak, bu tekniğin, farklı beyin görüntüleme elemanlarının çok yönlü etiketlenmesi için sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hayvan ve deneysel protokolleri PHS, Laboratuvar Hayvanları İnsani Bakım ve Kullanım Politikası uyarınca Hayvan Kaynakları (UÇAR), University of Rochester Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Burroughs Wellcome Fonu, Whitehall Vakfı ve Sloan Vakfı (AKM) Biyomedikal Bilimler Kariyer Ödülü NIH (EY012977) bağışları ile mümkün olmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
