Summary
Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.
Abstract
Injeção intracraniana de vetores virais projetadas para expressar uma proteína fluorescente é uma técnica de rotulagem versátil para visualização de subgrupos específicos de células em diferentes regiões do cérebro in vivo e em secções do cérebro. Ao contrário da injeção de corantes fluorescentes, rotulagem viral oferece segmentação de tipos de células individuais e é menos caro e demorado do que estabelecer linhas de ratinhos transgénicos. Nesta técnica, um vetor adeno-associado (AAV) viral é injetado intracraniana usando coordenadas estereotáxica, uma micropipeta e uma bomba automatizada para entrega preciso de AAV para a área desejada com o mínimo dano ao tecido circundante. Parâmetros de injeção pode ser adaptado para experimentos individuais, ajustando a idade do animal em injeção, injeção de localização, volume de injeção, a taxa de injeção, sorotipo AAV eo promotor dirigindo a expressão do gene. Dependendo das condições de escolhido, virally induzida a expressão do transgene pode permitir a visualização de grupos de células, as células individuais ou multa processos celulares, até o nível das espinhas dendríticas. O experimento mostrado aqui representa uma injeção de double-stranded AAV expressando a proteína fluorescente verde para a rotulagem de neurônios e células gliais no córtex visual primário do mouse.
Protocol
1. Manuseio e Armazenamento de vírus
- Uma protecção adequada e técnicas de manejo devem ser escolhidos com base no nível de biossegurança do vírus para ser usado. Estas práticas podem ser encontrados em Biossegurança em Microbiologia e Biomédica ª edição Laboratories 5, disponível no site do CDC
( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). O uso de vetores AAV é aprovado para o Nível de Biossegurança 1 (NB-1). Para o experimento mostrado aqui, um jaleco e luvas vai ser usado durante o manuseamento do vírus, de acordo com os procedimentos para a manipulação de NBS-1 agentes. - Para preservar a atividade do vírus é melhor dividi-lo em pequenas alíquotas para evitar o congelamento e descongelamento repetidos.
- Prepare um Gabinete de Biossegurança (BSC) Classe II de alíquotas de vírus por limpar o BSC de quaisquer objetos desnecessários e esterilizar a superfície com EtOH 70%. Coloque um copo contendo solução de água sanitária a 10% no capô para a recolha de resíduos contaminados AAV. Também colocado no BSC são estéreis tubos de 0,5 ml e um recipiente de gelo seco.
- Descongelar estoque viral no gelo fora do BSC.
- Vortex vírus e abrir o tubo dentro do BSC.
- Pipetar volume da alíquota desejada (por exemplo, 5 mL) em um tubo de 0,5 ml, fechar o tubo e colocá-lo no gelo seco para flash-freeze o vírus.
- Quando todos os vírus foi aliquotado, alienar o tubo de vírus e ponteiras no contentor de resíduos contendo lixívia a 10%.
- Remova o recipiente de resíduos da capa e adicionar água sanitária a 10% adicionais, em seguida, despeje a lixívia na pia. Descarte de resíduos plásticos em um recipiente biohazard conforme instruído pelo oficial de seu instituto de biossegurança.
- Limpar qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus com água sanitária a 10%. Descarte as luvas.
- Alíquotas armazenar em freezer -80 C °.
2. Cirurgia
- Cobrir a área cirúrgica com papel absorvente laboratório banco. Instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados e cirurgia feita sob condições assépticas, de acordo com a biossegurança de sua instituição e as diretrizes de uso animal.
- Escolha uma área adjacente à área cirúrgica, que será dedicado a carregar o micropipetas com o vírus, e cobri-lo com papel absorvente laboratório banco. Transferir uma parte alíquota do vírus em um recipiente de gelo nesta área e permitir que o vírus para descongelar em gelo como a cirurgia está sendo realizada.
- Configuração de um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área dedicada vírus manuseio para a eliminação de pontas de pipeta, etc, que entram em contato com o vírus.
- Puxe uma micropipeta de vidro Wiretrol a um diâmetro da ponta de aproximadamente 20 microns. Coloque uma pequena gota de óleo mineral na extremidade sem corte da micropipeta e inserir o êmbolo de arame fornecido com o micropipetas.
- Assegurar a micropipeta no grampo do braço micropump.
- Injetar um rato por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,5 mg / kg. Anestesiar o rato com Avertin via intraperitoneal com uma dose de 200 mg / kg e remover o cabelo do topo da cabeça com uma tesoura cirúrgica, certificando-se de deixar margens grande o suficiente para impedir que o cabelo de entrar na incisão.
- Anexar uma manta de aquecimento à base de um stereotax para manter uma temperatura corporal de 37 ° C durante toda a cirurgia e segura o mouse na stereotax.
- Banhar a cabeça com três esfrega alternadas de etanol e betadine para esterilizar a área.
- Coloque uma gota de TOBRADEX pomada em cada olho para manter os olhos úmidos durante a cirurgia.
- Faça uma incisão abaixo da linha média da cabeça e puxe a pele de volta para expor o crânio.
- Remova cuidadosamente a fáscia do crânio usando uma pinça de ponta fina.
- Localizar a área a ser injetado usando coordenadas estereotáxica e marcar o crânio com uma caneta cirúrgica.
- Usando uma broca de dentista com um 1,4 milímetros rebarba, uma área fina do crânio de aproximadamente dois milímetros de diâmetro, até as rachaduras do crânio, dividindo a área diluído em vários segmentos.
- Todo esse procedimento, manter o crânio úmido com aplicações de soro fisiológico estéril.
- Realizar uma craniotomia delicadamente removendo os segmentos crânio diluído com extra-fina com ponta fórceps.
3. Preparação de injeção
- Com um KimWipe colocado sobre a tampa, abra o tubo de vírus e de pipeta 1.5uL (para uma injeção 1uL) do vírus em um pequeno pedaço de parafilme.
- Coloque a ponta da micropipeta para o estoque viral e retirar manualmente o êmbolo. Se a dificuldade é experimentada desenho estoque viral para a micropipeta, a ponta pode ser ligeiramente aumentada ser uma perfuração KimWipe com a micropipeta para quebrar uma pequena parte do vidro.
- Braço inferior micropump em êmbolo até uma pequena quantidade de vírus é dissipada a partir da ponta da micropipeta. Remover esta pequena gota com um cotonete e aplicador de descarte em erascontainer e.
- Aplique uma gota de óleo mineral para a ponta da micropipeta para evitar o entupimento como a micropipeta é abaixado no cérebro.
4. Injeção de vírus
- Usando o X e Y estereotáxica coordenadas, a posição da micropipeta sobre a área a ser injetada. Neste experimento, os estereotáxica coordenadas utilizadas para localizar córtex visual primário é posterior ao bregma 2,7 milímetro e 2,5 mm lateral à linha média. Muito lentamente o micropipeta (a uma taxa aproximada de 1mm/1minute) para a posição Z adequada.
- Digite os parâmetros de injeção desejada na caixa de controlador de SYS MICRO4 micropump e iniciar a injeção. Para esta experiência, 1 microlitro mais de 10 minutos será usado como uma taxa de injeção.
- Quando a injeção é terminar, deixe a pipeta para descansar por 1-2 minutos para evitar o efluxo do vírus durante a remoção. Após este período, muito lentamente remover a micropipeta do cérebro (mesma taxa acima).
- Sutura no couro cabeludo e selá-lo com cola de tecido. Injetar o animal por via subcutânea com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg a cada 8-12 horas nas próximas 72 horas, ou enquanto o animal está exibindo sinais de dor. Permitir que o animal se recuperar sob uma lâmpada de calor até que esteja deambulando e pronto para ser devolvido à sua gaiola. Experimentos com imagens pode ser iniciada após o tempo de incubação desejado (dias a semanas após a injeção viral).
5. Limpeza
- Lavar a micropipeta com lixívia a 10% e descartá-lo em um recipiente adequado.
- Dispor de recipiente de resíduos da mesma maneira como Seção 1.
- Descarte o papel bancada do laboratório em bin de risco biológico e limpar todas as superfícies e instrumentos que possam ter estado em contacto com o vírus com água sanitária a 10%.
- Vírus não utilizados podem ser congelados novamente, tendo em mente que repetidos de congelamento / descongelamento causar degradação do vírus.
6. Resultados representante
Figura 1. Transduzidas neurônio após a injeção de double-stranded adeno-associated virus sorotipo 1 (dsAAV S1) carregando proteína verde fluorescente (GFP) sob controle do promotor CMV. O corpo da célula, bem como dendritos proximais e distais são claramente visíveis nas seções fixas fotografada usando um microscópio de epifluorescência. Barra de escala = 100 mm.
Figura 2. Labeling típico de uma injeção do vírus intracraniana em córtex visual primário usando S1 dsAAV mostrando a extensão da disseminação viral, assim como neurônios rotuladas, glia e processos. Barra de escala = 250 mM.
Figura 3. Rotulagem de células no hipocampo usando S1 dsAAV. Barra de escala = 250 mM. Estes números são adaptados de Lowery et al. 2009 1
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Discussion
Virally mediada entrega do gene tem um grande potencial para o estudo de processos neurológicos e tratamento de distúrbios cerebrais 1,2,3. A grande versatilidade desta técnica também pode ser explorada para fluorescente rótulo células para geração de imagens tanto in vitro como in vivo 4. Aqui demonstramos um procedimento detalhado para a transdução de neurônios e células gliais no córtex visual do rato usando um double-stranded do vírus adeno-associação expressando a proteína verde fluorescente melhorada.
Embora esta técnica é relativamente simples, há uma série de detalhes técnicos que precisam ser considerados. Um fator importante é a injeção induzida por dano ao tecido - portanto, é crucial ter muita cautela durante a cirurgia e inserção / remoção da micropipeta. A cirurgia não pode resultar na alteração das estruturas a ser trabalhada. Além disso, depois de carregar o vírus para a micropipeta, muito cuidado deve ser tomado para limpar as bolhas de ar na ponta da pipeta e garantir o volume adequado é injetado. Redução do micropipeta um pouco além da meta Z-coordenar, em seguida, retirá-la na posição adequada pode evitar vírus de transbordar para fora do local da injeção. Ao escolher um tempo de incubação, permitindo que o tempo adequado para a expressão do gene viral deve ser considerada. Isso vai variar de acordo com o vírus utilizado. A resposta imune limitada pode ser obtida pela injeção. Em nossa experiência, essa inflamação é geralmente restrito à faixa de agulha e pode ser evitada por imagem longe da vista de injeção (aproximadamente 50 μms ou mais). Por último, se as seções do cérebro estão a ser montados em lâminas, o uso de um meio de montagem Antifade é sugerido para manter a fluorescência.
Injeção intracraniana de vetores virais tem várias vantagens técnicas em relação às técnicas rotulagem outros. Através do uso de coordenadas estereotáxica e volume injetado a modulação, etiqueta fluorescente pode ser precisamente localizado em uma área de interesse. A quantidade de transdução pode ser alterado, ajustando o volume de injeção, a título de vírus ou o tempo de sobrevivência, permitindo a visualização de qualquer grupo de células ou células individuais. Além disso, o uso de vírus diferentes (por exemplo lentivírus, herpes vírus adenovírus,) também pode modular o tempo e quantidade de proteína fluorescente expressa, bem como os tipos de células-alvo. No geral, esta técnica pode fornecer para a rotulagem muito versátil de elementos diferentes do cérebro para a imagem latente.
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Disclosures
Os protocolos experimentais animais e foram aprovados pela Universidade de Rochester University Comissão de Recursos Animais (UCAR), em conformidade com o PHS Política de Assistência Humanitária e Uso de Animais de Laboratório.
Acknowledgments
Este trabalho só foi possível por concessões do NIH (EY012977), um Prémio Carreira na de Ciências Biomédicas da Burroughs Wellcome Fund, a Fundação Whitehall, e da Fundação Sloan (AKM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| St–lting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | |
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR international | 5-000-1001 or 53480-287 | |
| Mineral oil | VWR international | 29447-338 | |
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| Sutures | VWR international | 95056-952 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
