Summary
פיתחנו טכניקה רגישה תווית הדנ"א המיטוכונדרי מסונתז החדש (mtDNA) בתוך תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של Edu יחד עם פרוטוקול tyramide הגברה (TSA) אות לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים.
Abstract
המיטוכונדריה הם הרגולטורים העיקריים של אנרגיה תאית biogenesis המיטוכונדריה היא מרכיב חיוני של ויסות מספר המיטוכונדריות בתאים בריאים 1-3. גישה אחת לניטור biogenesis המיטוכונדריה היא למדוד את שיעור ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) שכפול 4. פיתחנו טכניקה רגישה תווית mtDNA מסונתז החדש של תאים בודדים כדי ללמוד biogenesis mtDNA. הטכניקה משלבת שילוב של 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) 5-7 עם הגברה אות tyramide (TSA) 8 פרוטוקול לדמיין שכפול mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים. Edu עדיפה אנלוגים thymidine אחרים, כגון 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), כי התגובה הראשונית לחץ Edu התווית 5-7 אינו מחייב את הטיפולים הקשים חומצה או אנזים מעכל הנדרשים חשיפת epitope BrdU . תיוג מתונה יותר של EDU מאפשרת השוואה ישירה ההתאגדות שלה עם סמנים תאיים אחרים 90-10. היכולת לחזות ולכמת biogenesis mtDNA מספקת כלי הכרחי לחקירת המנגנונים המשמשים להסדיר biogenesis המיטוכונדריה וגם יספק תובנות בפתוגנזה הקשורות רעילות התרופה, הזדקנות, סרטן ומחלות ניווניות. הטכניקה שלנו הוא ישים עצב סנסורי כמו גם סוגי תאים אחרים. השימוש בטכניקה זו כדי למדוד biogenesis mtDNA יש השלכות משמעותיות לקדם את ההבנה של הפיזיולוגיה הן הסלולר הרגיל, כמו גם מדינות מחלה לקוי.
Protocol
1. הכנה של נוירונים
- גנגליון השורש הגבי (DRG) הנוירונים גדלים על סטריליות (autoclaved) 12 מ"מ זכוכית coverslips בצלחת 24 גם תרבות.
- המניה 10 מ"מ EDU (ב DMSO, לחץ זה Edu microplate Assay קיט) הוא בדרך כלל מדולל 1:100 במדיום תרבות לבצע פתרון Edu 10X (100 מיקרומטר) ומהלה 1:10 לתוך התרבות בארות (למשל 30 μL הפתרון Edu 10X לתוך סכום כולל של 300 μL של המדיום תרבות). נוירונים DRG מודגרת בריכוז הסופי של Edu 10 מיקרומטר ב 37 ° C ו 5% CO 2 בין 2-24 שעות. משך הזמן תלוי כמה טיפולים לשבש את שיעור סינתזה mtDNA.
- במנדף קטר, נוירונים DRG המתוקנות paraformaldehyde 2% עבור 10-15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף פעמיים 1X PBS 2-5 דקות כל אחד לשטוף ומאוחסנים טרי 1X PBS עד חודש 1 ב 4 ° C.
- Coverslips מועברים עם קנס שקצהו מלקחיים לחדר לח מוכן (צלחת קורנינג המבדק עם תחתית מכוסים שחור לעומת זאת, עטוף בנייר אלומיניום כדי להגן על רכיבים רגישים לאור humidified עם Kimwipes מים רווי) והניח על גיליון Parafilm M המספק משטח הידרופובי להגביל את פתרונות coverslip. פרוטוקול להלן מיועד 28 coverslips פתרונות מוכנים 32 coverslips (כ נפח תוספת 14%). פתרונות עם רכיבים יקרים או מוגבל נעשים כך 75-80 μL משמשים על כל coverslip. אחרת, 200-300 μL משמשים פתרונות לרחוץ ביסודיות כדי לחסום לשטוף את הפתרונות הקודמים.
- Re-1X להחיל PBS כדי לכסות את פני השטח של כל coverslip (200-300 μL). הכן את assay לחץ אותו tyramide הגברה אות ערכות כמתואר להלן ועל פי הוראות היצרן.
הכנת לחץ Edu-IT microplate Assay Kit
רוב המרכיבים של ערכת לחץ זה Assay microplate Edu לבוא מוכנות מראש ומאוחסנים ב 4 ° C [לחץ 2x-IT הצפת תגובה (E רכיב 10x), CuSO4 (100 מ"מ, Component F), לחץ זה Edu מקבע ( מאגר רכיב D) חסימה (רכיב H 2x)]. לחץ זה תוסף Edu חוצץ (Component G 10x) מאוחסן ב -20 ° C כדי למנוע את הפיכת צהוב חום לאורך זמן. רכיב זה סובל חזר להקפיא להפשיר מחזורים.
גרין אורגון 488 אזיד (ב Component) צריך להיות מחולק aliquots קטנים (1-20 μL) כדי למזער להקפיא להפשיר מחזורים המאוחסן -20 ° C.
כדי להכין מלאי של פתרון האנטי אורגון גרין HRP המצומד (Component אני), להוסיף 75 μL של מילי ש DH 2 O ל הבקבוקון. מערבבים על ידי pipetting עדין או על ידי היפוך כדי למנוע הקצפה ולאחסן ב 4 ° C. אל מערבולת.
הכנת ערכת ה-TSA # 12, עם HRP אנטי הארנב עיזים IgG ו אלקסה פלואוריד 488 ערכת Tyramide
כדי להכין את הפתרון מניות tyramide, לפזר את חומר מוצק (אלקסה פלואוריד 488, tyramide רכיב A) 150 μL של DMSO (רכיב B). הפוך את הבקבוקון מספר פעמים כדי לפזר כל ציפוי tyramide הצדדים של הבקבוקון. מלאי חנות פתרון aliquots קטנים (1-20 μL) בשעה ≤ -20 ° C, מיובש ומוגן מפני אור.
2. לחץ זה 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EDU) תיוג
הערה: כל הפתרונות יוסרו עם פיפטה נורה להעביר עם טיפ 200 μL מודבקת סוף בעדינות כדי להסיר תאים נוזלים ללא הפסד. הימנע משימוש קו ואקום, אשר בדרך כלל להסיר פתרונות גם במרץ. פיפטה נורה משמש בעדינות להציף coverslips עם μL 200-300 של פתרונות לשטוף ביסודיות לשטוף את הפתרון הקודם.
- תאים הם permeabilized עם 0.1% Triton-X-100 בפתרון PBS 1X למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח מכוסה. השתמש ב 1% Triton-X-100 פתרונות המניות.
- הפוך את 3000 μL של 0.1% טריטון-X-100 על ידי הוספת 300% μL 1 Triton-X-100 מניות 2700μL 1X PBS.
- השתמש 75-80 μL לכל coverslip.
- הסר את X-100 Triton פתרון ולשטוף פעמיים עם 1X PBS.
- פעילות peroxidase אנדוגני הוא הרווה ב -1% H 2 O 2 בתמיסה PBS 1X במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מדולל 30% H 2 O 2 פתרון עם 1X PBS. פתרון זה צריך להיעשות טרי אבל יכול להתבצע במהלך השלב permeabilization מעל 10 דקות (שלב 3.1).
- הפוך את 3000 μL של 1% H 2 O 2 על ידי הוספת 100% μL 30 H 2 O 2-2900 μL 1X PBS.
- השתמש 75-80 μL לכל coverslip.
- הסר את הפתרון peroxidase ולשטוף פעמיים עם 1X PBS.
- לחץ זה Edu התגובה
- במשך 32 coverslips (32 x 80 μL =ΜL 2560) סך של 2,560 μL הוא זקוק. התגובה 2x הוא עשה 1280 μL, אשר הוא חצי מהנפח הכולל של התגובה.
- טרי להכין את הקוקטייל Click-IT התגובה לפני תחילת התיקון שלאחר 5 דקות (שלב 3.5 להלן).
- מערבבים את קוקטייל ידי pipetting למעלה ולמטה. אל מערבולת בעת קבלת תגובה זו.
2 x קוקטייל התגובה
רכיבים הם מן לחץ Edu-IT microplate Assay Kitחצי נפח: 1280 μL מילי ש DH 2 O 1132.8 μL תגובת לחץ 2x-IT חוצץ (E רכיב 10x) 100.3 μL לחץ זה Edu תוסף חוצץ (G רכיב 10x) 25.6 μL CuSO 4 (100 מ"מ, ו רכיב) 25.6 μL אורגון גרין אזיד (מרכיב) 6.4 μL סך הכל 1290.7 μL
הערה: בשימוש מעל כרכים הם יחסי הכרכים המפורטים לחץ Edu-IT ערכת כיוונים microplate Assay. היקף הסופי של קוקטייל התגובה היא מעט יותר μL 1280. - לחץ זה 2X התגובה מדולל עם נפח שווה של לחץ זה Edu מקבע (Component D) ממש לפני השימוש. ערבוב האלה יחד עושה פתרון אחיד התגובה coverslips כל.
- הוסף 1290.7 μL לחץ Edu-IT מקבע (רכיב ד ') על קוקטייל 1290.7 התגובה μL. השתמש 75-80 μL לכל coverslip.
- פוסט לתקן את הנוירונים עם לחץ זה Edu מקבע (רכיב ד ') במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר לתקן ולהוסיף קוקטייל התגובה מלמעלה (שלב 3.4). מכסים כדי להגן מפני אור דגירה במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות להסיר את קוקטייל התגובה. שטפו פעמיים עם הצפת בדילול חסימת 1X (2X Component H).
- הפוך את 5200 μL של הצפת 1X חסימת ידי דילול 2600 מאגר חסימת μL (2x Component H) עם נפח שווה של MilliQ ד H 2 O (2600 μL). השתמש 75-80 μL לכל coverslip.
- תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית, לבדוק מכתים גרין אורגון בגרעין השליטה של תאים פעילים mitotically.
3. Tyramide אותות הגברה (TSA) של EDU אותות
- הוסף 1% פתרון ה-TSA לחסום coverslip כל דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הפוך את μL 6000 של פתרון ה-TSA 1% לחסום ידי במשקל 0.06 גרם מגיב חסימת ה-TSA (TSA ערכת # 12, Component D) הוספתו 6000 μL 1X PBS. וורטקס לערבב. תוספת של סרום עיזים 5% בפתרון ה-TSA 1% לחסום לעיתים קרובות לעזור להפחית את הלא ספציפית מחייב.
- בקצרה ספין אנטי אורגון גרין חזרת הנוגדנים מצומדות peroxidase מניות (Component אני Assay של Click-IT microplate EDU), מוכן 2-24 שעות מראש של ה-TSA. לדלל את הנוגדן העיקרי 1:300 בתמיסה של 1% TSA חסימת להפוך פיפטה או מעלה מטה בעדינות לתערובת. אל מערבולת כדי למנוע שיבוש הנוגדנים HRP-מצומדות. הסרה של 1% פתרון ה-TSA לחסום, להוסיף 75 μL כדי לדגור coverslip כל לילה בשעה 4 ° C.
- הנוגדן ניתן להשתמש מרוכז יותר, כגון 1:150, אך הוא מסופק כמויות מוגבלות, ולכן משתמשים בו במשורה. שוב, תוספת של סרום עיזים 5% בפתרון ה-TSA 1% לחסום לעיתים קרובות לעזור להפחית את הלא ספציפית מחייב של נוגדנים נגד אורגון חזרת peroxidase גרין מצומדות.
- הפוך את 2560 μL של פתרון 1:300 נוגדן ידי הוספת 8.53 μL של הארנב המניות אנטי אורגון Green-HRP (לחץ-iT Edu microplate Assay) עד 2560 μL 1% TSA חסימה. מערבבים על ידי pipetting היפוך עדין או.
- למחרת, להסיר את הפתרון נוגדן ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. דגירה coverslips בכביסה הסופי של 30-60 דקות נוספות בטמפרטורת החדר על מנת להבטיח כי נוגדנים מאוגד העיקרית היא הוסרה.
- הכן את התגובה Tyramide עבור μL 2560 (32 x 80 coverslips μL).
- הפוך את 400 μL של פתרון 0.15% H 2 O 2 (100x) על ידי הוספת 2 μL של 30% H 2 O 2 (TSA ערכת # 12, Component ו) למאגר 398 הגברה μL (TSA ערכת # 12, E רכיב) . זה אמור להיות בסדר צורך לפני.
- לקבלת נפח סופי של 2560 μL לשלב:
- 25.6 Tyramide-488 μL (TSA רכיב ערכת)
- 2508.8 הגברה הצפת μL (TSA E ערכת רכיב)
- 25.6 μL 0.15% H 2 O 2 (מעל ל 0.0015% הסופי H 2 O 2)
- הסר 1X PBS ו דגירה עם התגובה Tyramide במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר התגובה Tyramide ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS, דוגרים בכביסה הסופי 30-60 דקות בטמפרטורת החדר כמו קודם.
- בדוק mtDNA תיוג תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית.
- Coverslips הר בשקופיות זכוכית מיקרוסקופ עם המדיום antifade הרכבה, כגון להאריך זהב עם DAPI. לחלופין, תיוג ו - Edu הגברה יכול להיות מלווה immunocytochemistry ניאון סטנדרטית התווית סמנים תאיים אחרים.
4. נציג תוצאות: ויזואליזציה של שכפול דנ"א מיטוכונדריאלי כסמן biogenesis מיטוכונדריאלי
אנחנו מעוניינים כמה עצב סנסורי (איור 1) לווסת את מספר המיטוכונדריה. פרוטוקול זה יהיה תווית mtDNA מסונתז לאחרונה עם סמן פלואורסצנטי כדרך למדידת המיטוכונדריה חדש. שילוב של Edu נוקלאוטיד סינתטי ואחריו הכימיה לחץ על הגברה של אורגון ירוק אזיד ובעקבות עם Alexa-פלואוריד 488 תוצאות tyramide ב תיוג של mtDNA עם אות פלואורסצנטי ירוק (איור 2). אם נעשה בצורה נכונה, את אות ירוק מוגבר הוא מספיק גבוה יותר מאשר הקרינה רקע (כגון autofluorescence הסלולר או תוצר לוואי של התגובה HRP-TSA).
טכניקה זו נועדה תווית mtDNA משוכפל החדש כדי לחזות ולכמת biogenesis mtDNA בתוך תאים subcellular של נוירונים (איור 3). תיוג EDU מאפשרת immunocytochemistry ניאון לאחר התווית סמנים תאיים אחרים כגון neurofilament (איור 3D).
תגובת ה-TSA יכול להעשות גם עם אחרים tyramides אלקסה פלורסנט פלואוריד כגון Alexa פלואוריד 594-tyramide. התוצאה היא אות ירוק גרעינית פלורסנט מן התגובה אורגון ירוק אזיד לחץ בגרעין, אך אין אות ירוק mtDNA, אשר לגילוי לפני TSA. הגברה עם אלקסה פלואוריד 594-tyramide מעצים את התווית גרעיני חושף את Edu שולבו mtDNA עם אות ניאון אדום (איור 4). הליך הגברה דומה משמש לדמיין שילוב BrdU לתוך mtDNA מסונתז החדש (איור 5), לעומת זאת, שיטה זו דורשת צעד נוסף כדי לשחזר את epitope BrdU על ידי חומצה או קשים (HCL) או אנזימים לעיכול, אשר אין צורך Edu תיוג.
באיור 1. נציג התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות של העוברית (משמאל) בוגר (מימין) גנגליון השורש הגבי (DRG) נוירונים המשמשים בדרך כלל. ברים ניתוח = 10 מיקרומטר.
איור 2. תרשים סכמטי המייצג את ההליך תיוג Edu ב mtDNA עם אות פלואורסצנטי ירוק. סכמטית מייצג את פרוטוקול שלושה שלבים תיוג Edu ב mtDNA עם אות פלואורסצנטי ירוק. Mitotically פעיל F11 תאים נוירובלסטומה לשמש כביקורת חיובית להמחיש את דפוס תיוג של Edu אשר התאגדה ב-DNA המיטוכונדרי גרעיני. הצעד הראשון (P1) היא לשלב אנלוגי thymidine לתוך mtDNA מסונתז לאחרונה על ידי דוגרים תאים בנוכחות edu. השלב השני (P2) מבוססת על כימיה לחץ התווית Edu משולב עם אורגון ירוק אזיד. אות ירוק גלוי הגרעינים של תאים משוכפלים DNA הגרעיני שלהם. השלב האחרון (P3) הוא להגביר את Gr אורגוןeen-אזיד האות על ידי דוגרים עם נוגדן HRP-מצומדות ארנב נגד אורגון הירוק ואחריו הדגירה עם אלקסה פלואוריד 488 tyramide שכותרתו בנוכחות מי חמצן (H 2 O 2) לדמיין אות ירוק mtDNA.
איור 3. Edu תיוג של mtDNA בכל גנגליון השורש הגבי (DRG) נוירונים. נוירונים מודגרת עם Edu ואת האות מוגבר לאחר מכן לחשוף mtDNA כי שולבו edu. תמונות פלואורסצנציה נציג מעולף על האור המועבר מראה אותות punctate הירוק של Edu מוגבר (Edu-OG-TSA, ירוק) שולבו mtDNA מסונתז החדש של שני עוברי (א) ו מבוגר (BD) נוירונים DRG. ההליך תיוג EDU מאפשרת מכתים immunofluorescence הבאות של סמנים עצביים כגון neurofilament (ד ', αNF, באדום). ברים סולם = 10 מיקרומטר.
איור 4. תרשים סכמטי המייצג את ההליך תיוג Edu ב mtDNA עם אות ניאון אדום. סכמטית מייצג את פרוטוקול שלושה שלבים תיוג Edu ב mtDNA עם אות ניאון אדום. Mitotically פעיל F11 תאים נוירובלסטומה לשמש כביקורת חיובית להמחיש את דפוס תיוג של Edu אשר התאגדה ב-DNA המיטוכונדרי גרעיני. הצעד הראשון (P1) היא לשלב אנלוגי thymidine לתוך mtDNA מסונתז לאחרונה על ידי דוגרים תאים בנוכחות edu. השלב השני (P2) מבוססת על כימיה לחץ התווית Edu משולב עם אורגון ירוק אזיד. אות ירוק גלוי הגרעינים של תאים משוכפלים DNA הגרעיני שלהם. השלב האחרון (P3) הוא להגביר את האות ירוק אזיד אורגון על ידי דוגרים עם נוגדן HRP-מצומדות ארנב נגד אורגון הירוק ואחריו הדגירה עם אלקסה פלואוריד 594 tyramide שכותרתו בנוכחות מי חמצן (H 2 O 2) לדמיין אדום אות ב mtDNA.
איור 5. BrdU תיוג הגברה tyramide אות באות פלואורסצנטי ירוק או אדום mtDNA. תרשים סכמטי מייצג את הליך תיוג BrdU ב mtDNA מסונתז החדש עם אות או פלואורסצנטי ירוק או אדום. השלב הראשוני הוא נדרש לשחזר את epitope BrdU על ידי חומצה או (HCL) או אנזימים לעיכול, אשר אין צורך תיוג edu. השלב הבא הוא דוגרים עם נוגדן עכבר העיקרית נגד BrdU. זה ואחריו דוגרים עם peroxidase חזרת (HRP), מצומדות נוגדן אנטי עכבר עז. בסופו של דבר, האות מוגבר עם tyramide שכותרתו fluorescently ירוק או אדום בנוכחות מי חמצן (H 2 O 2) לדמיין אות ב mtDNA.
Discussion
פיתחנו assay רגיש תווית mtDNA מסונתז החדש של תאים בודדים באמצעות הגברה של האות tyramide edu. אחת הבעיות הגדולות במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה היה תוצאות לא עקביות בין coverslips. שינויים נעשו הפרוטוקולים ערכת Invitrogen כדי למנוע ערבוב בנפחים קטנים על coverslips הפרט ולהפוך פתרונות הורים לשימוש coverslips כל. ΜL 75-80 בשימוש עבור כל 12 מ"מ זכוכית עגול coverslip הוא נפח אידיאלי כדי לכסות לחלוטין את פני השטח, תוך מתן פתרון מספיק כדי לתת תוצאות עקביות בין דגימות. פעמים דגירה ריכוזי מגיב היו אופטימיזציה אבל השיפורים ניתן לראות עם התאמות להם.
הפרוטוקול נועד לרוץ כל תהליך פעם. עם זאת, כמה צעדים כבר חזר עם פתרונות חדשים כדי להתאושש דגימות לאחר שנכשלו בניסיון הראשון. בפרט, תגובת לחץ צעדים EDU (3.4-3.6) כבר חזר ללא עלייה משמעותית הקרינה רקע. אנטי אורגון Green-HRP הדגירה נוגדן (4.1-4.3) לבין הגברה tyramide (4.4-4.5) יש גם צעדים חוזרים ונשנים, אך לעתים קרובות יותר תוצאות אות עני יחס רעש בגלל הקרינה רקע מוגבר.
ריאגנטים הרגישים ביותר הם תוסף לחץ Edu-IT חוצץ (Component G) הארנב נגד אורגון Green-HRP נוגדן (Component I) מן ערכת לחץ זה Assay microplate edu. תוסף זה לחץ Edu הצפת הופך בהדרגה צהוב לאורך זמן כאשר מאוחסנים 4 ° C ו בין 6-12 חודשים מכהה במידה ניכרת. אחסון של תוסף לחץ Edu-IT הצפת ב -20 ° C יהיה להקל על בעיה זו. תיוג צעדים הגברה tyramide העבודה הטובה ביותר כאשר הארנב נגד אורגון Green-HRP הנוגדן משמש בתוך 4-6 חודשים של ומשחזר אותו MilliQ DH 2 O.
תיוג קלה של Edu ב mtDNA מאפשר השוואה ישירה עם סמנים נוספים הסלולר 9-11 ומשפר את השירות של טכניקה זו על אנלוגים thymidine אחרים, כגון 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), אשר דורש טיפול קשה להתאושש שלה epitope בתוך הדנ"א. המעבדה שלנו 11-12 ועוד 13-15 השתמשו בהצלחה BrdU לתייג mtDNA. הטכניקה תיוג BrdU דומה לזו שבוצעה על Edu אבל יש כמה הבדלים חשובים (איור 5). לאחר השלב permeabilization המפורטים לעיל (3.1-3.2), epitope BrdU הוא התאושש בצעד denaturation (2 N HCl למשך 30 דקות ב 37 ° C ואחריו שלושה שוטף ב 1X PBS). BrdU מסומן ואז עם נוגדן ראשוני נגד BrdU (וקטור מעבדות מדוללת 1:50 בתמיסה של 1% חסימה של ערכת ה-TSA ו מודגרות לילה ב 4 ° C). צעד משני הנוגדנים יש צורך להגביר את האות BrdU (אנטי עכבר עז IgG מצומדות כדי HRP של ערכות ה-TSA # 2 ו - # 5, מדולל 1:100 בתמיסה של 1% חסימה מודגרות 45 דקות בטמפרטורת החדר) לפני TSA צעדים (4.3-4.5 לעיל). שיש שני אנלוגים thymidine, Edu ו BrdU, כדי mtDNA תווית יתרון לביצוע ניסויים תווית כפול שבו mtDNA יכול להיות מתויג ברצף ב הדופק תיוג פרדיגמות 11.
המעבדה שלנו היא באמצעות Edu ו BrdU תיוג של mtDNA לבחון את ויסות biogenesis המיטוכונדריה בהקשר של נוירופתיה סוכרתית, סיבוך נפוץ של מחלת הסוכרת. השתמשנו בהצלחה הגברה אות כדי למדוד שינויים mtDNA biogenesis נוירונים בודדים ב 11-12. טכניקה זו יהיה שימושי בניסויים אחרים שנועדו לחקור את המנגנונים של שכפול mtDNA מחזור או לזיהוי תרופות המעכבות סינתזה mtDNA. בנוסף לכך, העקרונות הבסיסיים של הגברה אותות Edu ו BrdU ניתן להחיל מחקרים אחרים כי ה-DNA למדוד שכפול או לתקן.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים NS-38849 ו DK-076160, Juvenile Diabetes Research Foundation המרכז לחקר סיבוכים של סוכרת, את תוכנית לנוירולוגיה מחקר גילוי אלפרד טאובמן א מכון המחקר הרפואי בבית אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו השתמשו מורפולוגיה וניתוח תמונה Core המרכז לחקר הסוכרת והכשרה מישיגן, שמומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט 5P60 DK-20572 מן המכון הלאומי של סוכרת עיכול מחלות כליה. המחברים מודים סקוט קלארק מ ט בדיקות מולקולריות / Invitrogen עצה יקר שלו על השונות לחץ Edu-IT תיוג ערכות התרומה הנדיבה של ריאגנטים כדי לתמוך בפיתוח הראשוני של הטכניקה הגברה edu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | |
| paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | |
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | |
| Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | |
| TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | |
| TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon International | AB1981 | |
| Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | |
| TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | |
| TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |
References
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
- Dimmer, K. S., Scorrano, L.
- Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J.
- Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
- Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
- Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
- Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
- Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).
