Summary
本协议描述了如何形象蛋白质相互作用使用基于FRET的接近检测。
Abstract
蛋白质 - 蛋白质相互作用，是所有重要的细胞过程的一个标志。然而，许多这些互动是短暂的，或大力弱，防止他们的身份，并通过分析传统的生物化学方法，如免疫共沉淀。在这方面，已经彻底改变了基因encodable的荧光蛋白（GFP，RFP等）及其相关荧光光谱重叠，我们有能力监测在体内的弱相互作用，使用福斯特共振能量转移 （ FRET）1-3。在这里，我们详细介绍我们使用一个基于FRET的接近检测，监测上的内皮细胞表面的受体受体相互作用。
Protocol
该协议包括三个主要步骤。第一，一步一个哺乳动物表达载体的氨基端的CFP资格和/或YFP的单体版本将只简要地讨论你感兴趣的基因的克隆。第二和第三个步骤;载体DNA转成EA.hy926内皮细胞，并与FRET的共焦成像，在下文作更深入的概述。
1。 CFP和YFP嵌合受体的建设
感兴趣的受体被克隆氨基酸末端CFP和YFP单体的增强版本。 FRET的测定是经验性的，是严重依赖后，连接器之间的长度的跨膜跨越区域，并开始荧光 1 。因此，几个不同长度的连接器，必须探索新的受体对每个正在调查。
- 进入的pcDNA3.1吸湿R或含有单体C或YFP的（这可以从我们的实验室获得的矢量） 新 ř载体，NheI / EcoRI位点克隆到您感兴趣的受体。 *注意：如果有必要，NheI包括SpeI和XbaI其他兼容的几个酶。
- 连接反应转换成适当的endA1 recA基因主管细胞系（我们经常使用MACH1）。其次DNA测序验证突变的情况下插入存在的屏幕殖民地。
- 取得成功的分子克隆构象后，准备在无菌水或使用Qiagen公司，或类似，DNA的试剂盒TE转染级的载体DNA。评估浓度和纯度，采用紫外光谱。典型的DNA产量应在100-200微克，这是常规稀释到1μg/μL的工作股票的范围。
2。 EA.hy 926细胞的转染
- 拆分成MatTek盖玻片（0号）2毫升培养基的35 mm培养皿EA.hy 926细胞，生长在完全DMEM培养液（DMEM培养液10％小牛血清+ Pen. /链球菌。） 。保守，你可以得到融合菜从15厘米〜15道菜（〜90％融合翌日）。准备一盘，以评估每一个人的受体的表达，以及一盘每个受体对。
- 允许细胞在5％的CO 2气氛孵育过夜在37 ° C 。翌日，文化应约70-90％汇合。
- 转天，准备nucleolipid络合物8μL的Fugene6预热OptiMEM 200μL混合嵌合受体的载体DNA（2μL），2微克。对于受体对，染（见下面的讨论），每个受体共2微克，1微克。
- 轻轻颠倒混合。
- 继续在室温下孵育30分钟。
- 在发病潜伏期间，准备转染的细胞。吸新鲜的媒体和每盘用温PBS冲洗，并简要地前增加2毫升不含抗生素的预热完全DMEM培养液（DMEM培养基+胎牛血清）。重要的是避免青霉素和链霉素的存在，因为它们与Fugene6治疗期间，相当多的细胞毒性。
- 添加复杂的细胞明智的下降和一个额外的20-24小时内孵化，在37 °彗星在 5％的CO 2的气氛。
- 24小时后，小心吸媒体从细胞和吸管用抗生素新鲜完整的DMEM培养液。转染后，细胞存活率应保持比较高的，即应观察几乎无漂浮细胞。
- 基因表达是一个额外的转染后48-60小时后通常最大。然而，成像通常是可行的，在短短24小时。应为最佳的基因表达的时间当然实验。
3。共聚焦成像，FRET技术分析
活细胞成像的Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描配备蓝色二极管（405纳米），氩气（458，476，488，514纳米）显微镜。氦氖绿（543纳米），橙色氦氖（594纳米），和红色的氦氖（633 nm）的激光器，一个HCX PI阿婆63x/1.3 NA甘油浸入式物镜，机动XY阶段（Märzhäuser），和环境控制（温度，湿度和CO 2）的阶段，孵化器（PeCon）。实验控制是至关重要的，以消除荧光基团之间的排放渠道，以及评估的表达问题和非特异性荧光基团的多聚串扰。因此，单个荧光团的转染是利用设立每一个形象会话。负的FRET控制（使用已知的无相互作用的受体）将需要被执行，以确定背景的FRET的发生是由于过度表达。
- 为了消除CFP和YFP的排放渠道之间的串扰，将进入阶段孵化器的CFP的表达调控。使用白色的光，调整的Z板将重点放在细胞。
- SP设置窗口设置CFP排放检测到465-505 nm和YFP的525-600纳米。
- 同时监控的排放渠道，激发CFP的458纳米。 AOTF的使用，设置激光功率超过CFP YFP排放通道，以消除明显出血。保存该设置。
- 通过调整电源的激发下，在514 nm处表示只YFP的细胞执行在CFP通道YFP的串扰（使用YFP的表达调控）相同的控制。保存该设置。
- 未来的地方细胞共表达CFP和YFP进入阶段孵化器。使用徕卡共聚焦软件的序列设置，找到适当的膜定位表达CFP和YFP的水平相似。
- 使用徕卡软件受体光漂白程序，设置的供体和受体设置保存CFP和YFP设置，可敬。
- 放大到细胞，突出一个YFP的照片毁灭是发生在细胞膜，并开始计划的ROI（感兴趣区域）。
- 承兑人的照片销毁，调整的AOTF在514纳米至100％，并允许继续下去，直到YFP的排放量的70％已所剩无几的激光漂白。为了加快漂白，投资回报率通常选择在光栅的激光轴（X轴）。
- 在光漂白过程中，监测细胞的运动，并拒绝在XY平面明显运动中获得的测量，这些测量报告虚假的FRET效率。
- 前和后的漂白图像记录捐助国（CFP）和受体（YFP），FRET的效率计算公式为：FRET的效率 =（D - D 后前 ）/ D转换后 ，所有D后> ð前， 其中 D前和D 后是漂白后分别捐助力度。
- JMP软件（SAS）是用来确定实验变异程度。
4。代表性的成果
转染效率通常在30至40％之间。尽管以前的研究结果被别人，我们还没有看到一个载体转染和表达，有利于其他。事实上，我们经常观察一个嵌合体荧光基团或其他专属的表达。典型的FRET受体系统的效率之间的不同。对于领带的受体系统，典型值是20-28％和19-23％的内皮细胞上皮细胞。对于阴性对照，典型的效率都低于2-3％。有经验的变异程度将大大降低。
图1。转EA.hy 926细胞的代表图像 。）EA.hy 926细胞单层DIC的形象。二）（一）显示细胞的荧光图像。 c）覆盖（A）和（二）展示〜20％至30％的转染效率。
图2。代表承兑人的照片漂白FRET CFP和YFP发生在EA.hy926细胞的分析。CFP排放通道（顶部面板）和YFP的发射通道（上下两板）分别进行了监测前，后受体漂白。漂白实验受到限制，和FRET技术的绿色方框内的区域，计算值。 FRET的效率是一个绝对的范围从高（红色- 1.0）低（紫色- 0.0）上一个CFP / YFP的放大叠加显示，合并方向的目的形象。
Discussion
有几个步骤是成功的关键。其中最突出的是两者之间的嵌合受体表达的相对水平。为了规避这个问题，可能使稳定的细胞系，表达利益蛋白，或确定载体DNA的最佳比例，允许相当于表达。同样，由于非均匀转跨菜，蛋白水平，很少会相当于细胞间。因此，一定要注意，“低”，以区别于“高”expressors。 ，显示“平均”的蛋白质含量通常会产生可靠和可重复性的FRET效率。我们的实验室一直奉行以减轻这个问题的方法之一是使用腺和lenti病毒“甚至是”基因的表达。此外，一个替代的方法来确定受体照片漂白FRET效率是致敏的排放。虽然，尽管敏排放实时监测单细胞的潜力，我们已经发现受体光漂白更敏感和更可靠。
最后，利用FRET技术来监测蛋白相互作用，可以是具有挑战性的的，需要谨慎选择的膜结合受体的链接长度。此外，除了C / YFP往往大大影响内质网和高尔基体蛋白表达水平的聚集和结果。然而，短暂的，不稳定的，互动的，FRET是理想的方法利用。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢共聚焦显微镜的帮助下，斯科特亨德森博士。这项研究是从美国国立卫生1RO1CA127501研究院的资助，以WAB的目标，以及来自梅西癌症中心和医学院（VCU），WAB的显微镜，在VCU - DEPT试点项目的资金支持。神经生物学及显微解剖设施，支持，从NIHNINDS中心核心授予5P30NS047463资金中的一部分，。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
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