Summary
Detta protokoll beskriver hur bilden protein-protein interaktioner med hjälp av en FRET-baserad närhet analys.
Abstract
Protein-protein interaktioner är ett kännetecken för alla viktiga cellulära processer. Men många av dessa interaktioner är övergående, eller energiskt svaga, vilket förhindrar deras identifiering och analys genom traditionella biokemiska metoder som co-immunoprecipitation. I detta avseende har de genetiskt encodable fluorescerande protein (GFP, RFP, etc.) och tillhörande överlappande fluorescens spektrum revolutionerat vår förmåga att övervaka svag växelverkan in vivo på Förster resonans energy transfer (FRET) 1-3. Här detalj vi vår användning av en FRET-baserad närhet analys för övervakning av receptor-receptor interaktionen på endotelceller ytan.
Protocol
Protokollet består av tre stora steg. Den första, steget kloning av dina genen av intresse i ett däggdjur uttryck vektor amino-terminalt till monomera versioner av den gemensamma fiskeripolitiken och / eller YFP kommer bara att diskuteras i korthet. Den andra och tredje steg, transfektion av vektor DNA i EA.hy926 endotelceller, och konfokal avbildning med FRET, beskrivs mer ingående nedan.
1. Byggandet av den gemensamma fiskeripolitiken och YFP chimära Receptorer
Receptorer av intresse bör vara klonade amino-terminalt att monomera förbättrade versioner av den gemensamma fiskeripolitiken och YFP. Fastställande av FRET är empirisk och är kritiskt beroende av längden av länkaren mellan transmembrana spänner över regionen och början av fluoroforen 1. Därför måste flera olika längder länkare undersökas för varje ny receptor par under utredning.
- In i pcDNA3.1 hygro R eller neo R vektor som innehåller monomer C-eller YFP (denna vektor kan erhållas från vårt labb), klona dina receptor av intresse i NheI / EcoRI webbplatser. * Obs-Om det är nödvändigt NheI kompatibel flera andra enzymer inklusive SpeI och XbaI.
- Förvandla ditt ligatur reaktionen i en lämplig endA1 recA behöriga cellinje (vi rutinmässigt använder Mach1). Screen kolonier för förekomst av in följt av DNA-sekvensering för att kontrollera frånvaron av mutationer.
- Snart han fått inordning av framgångsrika molekylär kloning, förbereda transfektion kvalitet vektor DNA i sterilt vatten eller TE med Qiagen eller liknande kit DNA. Utvärdera koncentration och renhet med hjälp av UV-spektroskopi. Typiska avkastningen av DNA ska vara i intervallet 100-200 mikrogram, som rutinmässigt späds till en fungerande bestånd av 1 mikrogram / mikroliter.
2. Transfektion av EA.hy 926 celler
- Dela EA.hy 926 celler 4, som odlas i komplett-DMEM (DMEM 10% fetalt bovint serum + Pen. / Strep.) Till Mattek täckglas (nr 0) 35 mm rätter med 2 ml medium. Du kan konservativt få ~ 15 rätter (~ 90% konfluenta dagen därpå) från en 15 cm konfluenta maträtt. Förbered en maträtt för att utvärdera uttryck för varje enskild receptorn, samt en rätt för varje receptor par.
- Låt cellerna att inkubera över natten i 5% CO 2 atmosfär vid 37 ° C. Följande dag, bör de kulturer vara ~ 70-90% konfluenta.
- På dagen för transfektion, förbereda nucleolipid komplex genom att blanda 2 mikrogram av den chimära receptorn vektor-DNA (2 mikroliter) med 8 mikroliter av Fugene6 i 200 mikroliter av förvärmda OptiMEM. För receptorn par transfektera med 1 mikrogram i varje receptor, för totalt 2 mikrogram (Se även diskussionen nedan).
- Blanda varsamt genom inversion.
- Fortsätt att inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Under inkubationstiden, förbereda celler för transfektion. Sug av färska medier och tvätta varje platta försiktigt och kortfattat med varmt PBS före tillsats av 2 ml förvärmda komplett-DMEM utan antibiotika (DMEM + FBS). Det är viktigt att undvika förekomst av penicillin och streptomycin, eftersom de är betydligt mer toxiskt för celler under behandling med Fugene6.
- Tillsätt de komplexa droppvis till celler och inkubera i ytterligare 20-24 timmar vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär.
- Efter 24 timmar, försiktigt aspirera media från cellerna och pipettera färska komplett-DMEM med antibiotika. Efter transfektion bör cellviabiliteten förbli relativt högt, dvs nästan inga flytande celler bör följas.
- Genuttryck är vanligtvis maximal efter ytterligare 48-60 timmar efter transfektion. Det är dock avbildning vanligtvis möjligt på så kort som 24 timmar. Tidsförloppet experiment för optimal genuttryck ska utföras.
3. Konfokala Imaging och FRET Analys
Levande cell imaging utförs på ett Leica TCS-SP2 AOBS konfokala laserskanning mikroskop utrustat med blå diod (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm). gröna HeNe (543 nm), orange HeNe (594 nm) och rött HeNe (633 nm) lasrar, en HCx PI Apo 63x/1.3 NA glycerin-nedsänkning objektiv, en motoriserad XY stadium (Märzhäuser), och en miljömässigt kontrollerad ( temperatur, luftfuktighet och CO 2) steg inkubator (PeCon). Experimentella kontroller är avgörande för att eliminera fluoroforen överhörning mellan utsläpp kanaler samt att utvärdera frågor yttrandefrihet och icke-specifika fluoroforen multimerization. Som sådan är ensamstående fluoroforen transfections utnyttjas för att starta varje bild session. Negativa FRET kontroller (med hjälp av kända noninteracting receptorer) kommer att behöva utföras, för att avgöra bakgrunden FRET som uppstår på grund av över uttryck.
- För att eliminera överhörning mellan utsläpp kanaler för den gemensamma fiskeripolitiken och YFP, placera den gemensamma fiskeripolitiken uttryck kontroll till scenen inkubatorn. Använda vitt ljus, justera Z-plattan för att fokusera påtill cellerna.
- Ställ SP fönster inställningar för utsläpp detektion av GFP till 465-505 nm och YFP till 525-600 nm.
- Även övervakning både utsläpp kanalerna, hetsas den gemensamma fiskeripolitiken på 458 nm. Använda AOTF ställer lasereffekten att eliminera märkbara blöda över av den gemensamma fiskeripolitiken i YFP utsläpp kanal. Spara den här inställningen.
- Gör samma kontroll för YFP överhörning (med YFP uttrycket kontroll) i den gemensamma fiskeripolitiken kanalen genom att justera excitation effekt vid 514 nm för celler som uttrycker bara YFP. Spara den här inställningen.
- Nästa ställe celler samtidigt uttrycker den gemensamma fiskeripolitiken och YFP in på scenen inkubatorn. Använda sekvens inställning för Leica konfokala programvaran, lokalisera celler som uttrycker liknande nivåer av den gemensamma fiskeripolitiken och YFP med rätt membran lokalisering.
- Med hjälp av Leica acceptanten foto-blekning programmet, ställ in givare och acceptanten inställningar till din sparade gemensamma fiskeripolitiken och inställningar YFP, avsevärt.
- Zooma in i cellen, markera en ROI (region of interest), där foto-förstörelse av YFP skall ske på den cellulära membranet och börja programmet.
- För foto-förstörelse av acceptor, justera AOTF till 100% vid 514 nm och låt laser blekning att fortsätta tills 70% av YFP utsläpp har tagit slut. För att påskynda blekning, är ROI vanligtvis väljs i rastret axel laser (X-axeln).
- Under foto-blekning, övervaka den cellulära rörelsen och avvisa mätningar fås med märkbara rörelser i XY-planet, eftersom dessa mätningar kan rapportera falska FRET effektivitet.
- Före och efter bleka bilder registreras för både givare (GFP) och acceptor (YFP) och FRET effektiviteten beräknas som: FRET Eff = (D efter D för) / D tjänst för alla D inlägg> D pre där D före och D inlägg är givaren intensiteten före och efter fotoblekning respektive.
- JMP Software (SAS) används för att fastställa omfattningen av experimentell variation.
4. Representativa resultat
Transfektion effektivitet är vanligtvis mellan 30 till 40%. Trots tidigare fynd av andra, har vi inte sett att transfektion och uttryck av en vektor gynnar de andra. Ja, observerar vi ofta exklusiva uttryck för en fluoroforen chimär eller det andra. Typiska FRET effektivitet varierar mellan receptorer. För oavgjort receptorsystem, typiska värden är 20-28% för epitelceller och 19-23% i endotelceller. För negativa kontroller, typisk verkningsgrad ligger under 2-3%. Omfattningen av variationen kommer att minska betydligt med erfarenhet.
Figur 1. Representant bilder av transfekterade EA.hy 926 celler. A) DIC bild av EA.hy 926 cell monolager. B) Fluorescens bild av celler visas i (A). C) överlagring av (A) och (B) visar ~ 20-30% transfektion effektivitet.
Figur 2. Representant acceptor foto-blekning analys av FRET inträffar mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP i en EA.hy926 cell. Den gemensamma fiskeripolitiken utsläpp kanal (krönskivor) och YFP utsläpp kanal (nedtill, två paneler) var övervakas separat före och efter acceptor fotoblekning. Fotoblekning experiment var begränsad till, och FRET värden beräknade från regionen inom den gröna rutan. FRET effektivitet visas som en absolut sträcker sig från hög (röd-1.0) till låga (lila-0.0) på en förstorad överlagring av en gemensam fiskeripolitik / YFP samman bilden för en orientering syfte.
Discussion
Det finns flera steg som är avgörande för framgång. De mest framträdande bland dem är de relativa nivåerna på uttrycket mellan de två chimära receptorer. För att kringgå detta problem kan man göra stabila cellinjer som uttrycker både proteiner av intresse, eller identifiera optimala förhållandet mellan vektor-DNA för att möjliggöra motsvarande uttryck. Likaså på grund av icke-enhetlig transfektion över en maträtt, kommer proteinet nivåerna sällan lika mellan celler. Därför måste hänsyn tas för att skilja "hög" expressors från "låg". De som visar "genomsnittlig" nivåer av protein vanligen ge tillförlitliga och reproducerbara FRET effektivitet. En metod vårt labb har fortsatt att lindra detta problem är användningen av adeno och Lenti-virus för att "även" genuttryck. Dessutom en alternativ metod för att acceptanten foto-blekning för att bestämma FRET effektivitetsvinster sensibiliserade utsläpp. Även Trots möjligheterna till sensibiliserade utsläpp för att övervaka enskilda celler i realtid, har vi funnit acceptanten foto-blekning vara känsligare och mer tillförlitlig.
Slutligen kan använda FRET att övervaka proteininteraktioner vara utmanande och kräver noggrant urval av länkare längder för membranbundna receptorer. Dessutom tillägg av C / YFP ofta i hög grad påverkar nivån protein uttryck och resulterar i aggregering i endoplasmatiska retiklet och Golgi apparaten. Men för övergående eller instabil, interaktion, är FRET den idealiska metoden att använda.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill erkänna dr Scott Henderson för hjälp med konfokalmikroskopi. Denna forskning har finansierats med bidrag från National Institutes of Health 1RO1CA127501 till WAB samt pilotprojekt medel från Massey Cancer Center och School of Medicine (OAV) till WAB Mikroskopi utfördes vid OAV-Dept. för neurobiologi & Anatomy Mikroskopi Facility, som stöds, delvis med medel från NIHNINDS Center kärna bidrag 5P30NS047463.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
