Biology

DsRNA की स्त्री ए aegypti Mosquitos में इंजेक्शन

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/215

Brian M. Luna¹, Jennifer Juhn¹, Anthony A. James²

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Molecular Biology and Biochemistry, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine (UCI)

Summary

रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण मच्छरों में वेक्टर रोगजनकों के लिए जो जीन underly प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी सिद्ध कर दिया है. यह वीडियो प्रोटोकॉल एक महिला ए aegypti मच्छरों, जो डेंगू वायरस बंदरगाह में dsRNA इंजेक्षन जेम्स प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता विधि दिखाता है. इंजेक्शन सुई औजार, इंजेक्शन सेटअप से छेड़छाड़, और छाती में dsRNA इंजेक्शन के लिए तकनीक सचित्र है.

Abstract

Protocol

गिलास केशिका ट्यूब खींच द्वारा microinjection सुइयों बनाओ. हम Sutter साधन सीओ से सुई खींचने, (मॉडल पी 2000) का उपयोग करें. सुई खींचने कार्यक्रम विनिर्देशों हैं:

गर्मी: 275
fil: 3
vel: 37
डेल: 250
पुल: 125
सुई में पानी का एक ज्ञात मात्रा (जैसे, μl 1) लोड और मैन्युअल रूप से ठीक एक sharpie के साथ पैमाने पर निशान.
मच्छरों के लिए एक कप के बाद इंजेक्शन सेट. पहले 1000 μl विंदुक टिप के outmost टिप काटा. फिर, एक कप के पक्ष में एक छेद में कटौती और कप में पिपेट टिप के शेष भाग सम्मिलित हैं. कप के शीर्ष पर शुद्ध या ढक्कन रखो.
बर्फ के साथ दो स्टायरोफोम बक्से भरें. जगह एक stereomicroscope तहत आइस बॉक्स # 1 और बर्फ पर एक गिलास watchglass जगह.
सीओ ₂ और बर्फ # 2 बॉक्स में वयस्कों के साथ जगह कप के साथ वयस्क मच्छरों anesthetize .
DsRNA के इंजेक्शन के लिए सुई तैयार करो. इंजेक्शन ब्लॉक की प्लास्टिक की नली पर dsRNA के साथ भरा सुई (इंजेक्शन ब्लॉक का वर्णन नीचे देखें) रखो.
संदंश के साथ घड़ी का शीशा कप से एक anesthetized मच्छर ले जाएँ. मच्छर छल्ली पर इंजेक्शन सुई टिप तोड़ो. इस मच्छर त्यागें.
इंजेक्शन के लिए सुई मच्छर की छाती में डाला जाता है. अपने मुक्त हाथ से, "आराम" स्थिति से "इंजेक्शन स्थिति" सुई लगानेवाला पर वाल्व और समायोजित सवार सेक तक dsRNA के वांछित राशि इंजेक्शन किया गया है.
प्लेस के बाद इंजेक्शन कप में मच्छर इंजेक्शन.

इंजेक्शन ब्लॉक की स्थापना

एक राख ब्लॉक के लिए एक 50 मिलीलीटर सिरिंज ठीक.
सिरिंज के अंत तक कम से कम 2 हवा दुकानों के साथ एक समायोज्य 1 रास्ता वाल्व संलग्न.
एक हवा आउटलेट के लिए एक airtight प्लास्टिक की नली संलग्न.
नली के मुक्त अंत में एक micropipette अनुकूलक डालें.

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