Injektion av dsRNA till Kvinna A. aegypti Mosquitos

Summary

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som James labbet att injicera dsRNA i kvinnliga A. aegypti myggor, som hyser den denguefeber virus. Tekniken för kalibrering injektionsnålar, manipulera injektionen setup, och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Abstract

Omvänd genetiska metoder har visat sig extremt användbart för att avgöra vilka gener som underliggande motstånd mot vektor patogener i myggor. Denna video protokoll illustrerar en metod som James labbet att injicera dsRNA i kvinnliga A. aegypti myggor, som hyser den denguefeber virus. Tekniken för kalibrering injektionsnålar, manipulera injektionen setup, och injicera dsRNA i bröstkorgen illustreras.

Protocol

1. Gör mikroinjektion nålar genom att dra glas kapillärrör. Vi använder en nål avdragare från Sutter Instrument CO (modell P-2000). Nålen avdragare Programmet specifikationer:
   
   värme: 275
   fil: 3
   vel: 37
   del: 250
   PUL: 125
   
   
2. Ladda en känd volym (t.ex. 1 l) vatten i barr och manuellt markera skala med en fin Sharpie.
3. Sätt upp en efter injektion kopp för myggen. Först klippa yttersta spetsen av av ett 1000 l pipettspetsen. Sedan skär ett hål i sidan av en kopp och sätt in den återstående delen av pipettspetsen i koppen. Sätt ett nät eller lock ovanpå koppen.
4. Fyll två frigolit lådor med is. Placera isbox # 1 under ett stereomikroskop och placera ett glas klockglas på isen.
5. Bedöva vuxna myggor med CO ₂ och placera kopp med vuxna i isbox # 2.
6. Förbered nål för injektion av dsRNA. Sätt nål fylld med dsRNA på plast slang injektion blocket (för beskrivning av injektion blocket se nedan).
7. Flytta en sövda myggor från koppen till urglas med pincett. Break tips injektionsnål på mygga nagelband. Släng denna mygga.
8. För injektioner, är nålen sätts in i bröstkorgen av mygga. Med din fria hand, justera ventil på injektor från "viloläge" till "injektion position" och komprimera kolven tills önskad mängd dsRNA har injicerats.
9. Placera injiceras mygga in efter injektion kopp.

Injektion blockera upprätta

1. Fäst en 50 ml spruta med en aska block.
   
2. Fäst ett justerbart 1-vägs ventil till slutet av sprutan med minst 2 luftutsläpp.
   
3. Fäst en lufttät plastslang till 1 luftutsläppet.
   
4. Sätt in en mikropipett adapter i den fria änden av slangen.