Summary
Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio de James para inyectar dsRNA en hembras de A. aegypti, que albergan el virus del dengue. La técnica para la calibración de agujas de inyección, la manipulación de la configuración de la inyección, y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.
Abstract
Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio de James para inyectar dsRNA en hembras de A. aegypti, que albergan el virus del dengue. La técnica para la calibración de agujas de inyección, la manipulación de la configuración de la inyección, y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.
Protocol
- Hacen que las agujas de microinyección tirando tubos capilares. Nosotros usamos un extractor de aguja de CO Instrumento Sutter, (modelo P-2000). Las especificaciones extractor aguja programa son:
calor: 275
fil: 3
vel: 37
del: 250
pul: 125 - Cargar un volumen conocido (por ejemplo, un l) de agua en las agujas y el manual de marca de la escala con un rotulador fino.
- Establecer una taza después de la inyección para los mosquitos. Primero corta la punta más exterior de una punta de la pipeta 1.000 l. Luego, cortar un agujero en el lado de una taza e inserte la parte restante de la punta de la pipeta en el vaso. Poner una red o una tapa en la parte superior de la copa.
- Llenar dos cajas de poliestireno con hielo. Coloque la caja de hielo # 1 bajo un microscopio estereoscópico y el lugar un vidrio de reloj de cristal sobre el hielo.
- Anestesiar a los mosquitos adultos con CO 2 y la copa a cabo con los adultos en la caja de hielo N º 2.
- Prepare la aguja de la inyección de dsRNA. Inserte la aguja llena de dsRNA en la manguera de plástico de bloque de inyección (para la descripción de bloque de inyección ver más abajo).
- Mover un mosquito anestesiados de la copa para el vidrio de reloj con una pinza. Romper la punta de inyección sin aguja en la cutícula del mosquito. Deshacerse de este mosquito.
- Para inyección, se introduce la aguja en el tórax del mosquito. Con su mano libre, ajuste la válvula de inyección de "posición de descanso" a la "posición de inyección" y comprimir el émbolo hasta la cantidad deseada de dsRNA se ha inyectado.
- Lugar mosquito inyecta en la copa después de la inyección.
Bloque de inyección establecido
- Fijar una jeringa de 50 ml a un bloque de cemento.
- Adjuntar un ajuste de 1 vía válvula hasta el extremo de la jeringa con al menos dos salidas de aire.
- Conecte una manguera de plástico hermético para una salida de aire.
- Introduzca un adaptador micropipeta en el extremo libre de la manguera.
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