Summary
Nous fournissons une méthode pour isoler et cultiver des populations pures de cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC). VEC peuvent être isolées de chaque côté de la pointe ou un dépliant et immédiatement après, sous-jacente des cellules interstitielles (CIV) isolement est simple.
Abstract
Les valves cardiaques sont seul responsable du maintien du flux sanguin unidirectionnel à travers le système cardio-vasculaire. Ces minces, des tissus fibreux sont soumis à des contraintes mécaniques importantes car elles s'ouvrent et se ferment plusieurs milliards de fois sur une durée de vie. L'endurance incroyable de ces tissus est due à la valvulopathie résidents endothéliales (VEC) et les cellules interstitielles (CIV) qui ne cessent de réparation et de remodelage en réponse à des signaux locaux mécaniques et biologiques. Ce n'est que récemment que nous avons commencé à comprendre les comportements uniques de ces cellules, dont l'expérimentation in vitro a joué un rôle clé. Particulièrement difficile est l'isolement et la culture du CVE. Une attention particulière doit être utilisé à partir du moment où le tissu est retiré de l'hôte par plaquage finale. Nous présentons ici des protocoles pour l'isolement direct, l'isolement secondaires spécifiques, la culture, et la vérification des populations pures de CVE. Nous utilisons la digestion enzymatique suivie d'une technique de raclage tige doux pour déloger les cellules de surface seulement. Ces cellules sont ensuite recueillies dans un tube et centrifugée dans une pastille. Le culot est ensuite remis en suspension et plaquées dans des flacons de culture pré-enduites de collagène I matrice. Phénotype VEC est confirmée par le contact a inhibé la croissance et l'expression des marqueurs endothéliaux spécifiques tels que PECAM1 (CD31), facteur von Willebrand (VWF), et l'expression négative de l'actine musculaire lisse alpha (α-SMA). Les caractéristiques fonctionnelles de VEC sont associés à des niveaux élevés de LDL acétylées. Contrairement cellules endothéliales vasculaires, CVE ont la capacité unique de se transformer en mésenchyme, qui se produit normalement lors de la formation embryonnaire, la vanne 1. Cela peut également survenir lors de façon significative après confluentes prolongée de culture in vitro, ainsi le soin doit être fait pour le passage ou à proximité de confluence. Après isolement CVE, des populations pures de CIV peuvent ensuite être facilement acquis.
Protocol
1. Préparation
- Autoclave dans un instrument couvert plateau les éléments suivants:
- Pince tissus dentelé - Pour la manipulation des tissus dépliant
- Ciseaux Tissu (8 cm) - Pour couper le tissu dépliant et les cuspides
- Cotons-tiges - Pour isoler la couche endothéliale de la notice ou aube
- Faire solution de collagénase stérile
- Ajouter 4,0 g de poudre DMEM à 250 ml de 18 MQ eau.
- Ajouter 1,11 g de bicarbonate de sodium.
- Ajouter (600 U / ml) 180 000 unités de collagénase.
- Ajouter 1% (3 ml) de pénicilline / streptomycine.
- Ajuster le pH de la solution à 7,2.
- Porter la solution à 270 ml.
- Stériliser la solution en passant par un filtre de 0,2 um.
- Ajouter 10% (30 ml) de solution stérile de sérum de veau foetal.
- Faire stériles moyennes des cellules endothéliales
- Ajouter 6,7 grammes de poudre de DMEM à 400 ml d'eau 18 MQ.
- Ajouter 1,85 g de bicarbonate de sodium.
- Ajouter (50 U / ml) 25 000 unités d'héparine.
- Ajouter 1% (5 ml) de pénicilline / streptomycine.
- Ajuster le pH de la solution à 7,2.
- Porter la solution à 450 ml.
- Stériliser la solution en passant par un filtre de 0,2 um.
- Ajouter 10% (50 ml) de solution stérile de sérum de veau foetal.
- Faire stériles moyennes des cellules interstitielles
- Ajouter 13,37 grammes de poudre DMEM à 800 ml de 18 MQ eau.
- Ajouter 3,7 grammes de bicarbonate de sodium.
- Ajouter 1% (10 ml) de pénicilline / streptomycine.
- Ajuster le pH de la solution à 7,2.
- Porter la solution à 900 ml.
- Stériliser la solution en passant par un filtre de 0,2 um.
- Ajouter 10% (100 ml) de sérum bovin stérile.
2. Isolement des feuillets de la valve cardiaque
- Accise la racine aortique immédiatement et de façon aseptique du cœur après le sacrifice.
- Rincer soigneusement la racine aortique de sang avec le froid DPBS stérile. Il est impératif d'enlever tous les composants sanguins dès que possible pour limiter la mort VEC et la contamination bactérienne. Les antibiotiques et les antifongiques ne sont pas informés à ce stade car ils sont potentiellement dangereux pour la CVE.
- Isoler feuillets de la valve (3 par soupape) directement à partir de la racine et la placer dans un tube de 15 ml stériles coniques remplis avec 12 ml DPBS froid. Agiter plusieurs fois pour enlever les débris et remplir avec du DPBS frais.
- Transport au laboratoire sur la glace.
- Dès l'arrivée au laboratoire, placer le récipient avec le tissu sous la hotte stérile.
3. L'isolement de couche endothéliale
- Remplir un plat stériles 35mm avec 3 ml de solution de collagénase froid par la vanne (3 feuillets).
- Placez tous les trois folioles du tube 15 ml dans le plat rempli de la solution de collagénase.
- Incuber les tissus pendant 5-10 minutes à 37 ° C.
- Retirer délicatement la couche endothéliale par rotation d'un écouvillon sec stérile sur la surface de la notice. Le sens de rotation et la quantité de cisaillement appliquée est essentielle pour la pureté de votre échantillon. La rotation de l'écouvillon doit être dans une direction opposée au mouvement linéaire de votre main la création d'un cisaillement contrôlé. Ce cisaillement est ce que soulève les cellules endothéliales du tissu. La quantité de force appliquée doit être suffisante pour sentir la résistance du tissu, mais ne pénètrent pas la membrane basale.
- Occasionnellement, tamponnez l'écouvillon dans la solution de la collagénase pour déloger les cellules à partir des fibres pointe. Après écouvillonnage est complète, la texture de la couche endothéliale doit se sentir légèrement plus lisse qu'avant.
- Recueillir la suspension cellulaire / collagénase et le transfert dans un nouveau tube de 15 ml stérile.
- Centrifuger les tubes à 1000 tpm pendant 5 minutes pour culotter les cellules isolées et aspirer le surnageant. Si isoler des cellules interstitielles ainsi, effectuer ce protocole alors que ces cellules sont centrifugées.
- Ajouter 3 mL de milieu de porc à l'endothélium des tubes de 15 ml, centrifuger une deuxième fois, et les médias aspirer. Cette seconde centrifugation permet de filtrer certains des matériaux indésirables tels que les fibres pointe.
- Re-suspendre les cellules endothéliales centrifugé dans 5 ml de milieu porcine endothéliales et les cellules plaque dans un pré-enduites T-25 flacon avec du collagène (utiliser une fiole jaugée par tube de centrifugation).
- Laissez les cellules se développent au moins 2-3 jours avant de changer le support endothéliales. Cela permet de récupérer les cellules et se divisent depuis le processus d'isolement est assez dur et le rendement cellulaire peut être faible. Il est essentiel de cellules passage près confluent depuis l'inhibition de contact pourrait conduire à la transformation cellulaire.
4. Préparation de 60 mm pour boîte de culture isolement spécifique Side
- Ligne du verre de 60 mm des boîtes de Pétri avec du papier aluminium (2 plats en verre par leaflet). La feuille d'aluminium permet d'enlever la paraffine, de sorte que le plat en verre de Pétri peuvent être réutilisés pour d'autres isolements.
- Placez des perles de paraffine dans les plats, à moitié plein, et la couverture pour l'autoclavage.
- Une fois l'autoclave est complète et la paraffine est fondue, déplacer l'ensemble plat sur une surface plane fraîche. Comme la paraffine se refroidit, il durcit et créer une couche qui soutiendra piqûres d'aiguille.
- Après 30 minutes, le plat stérilisée peut alors être utilisé comme une chambre d'isolement pour immobiliser le tissu notice.
5. Isolement du côté couche endothéliale spécifiques
- Retirez les tracts des tubes de 15 ml et placer sur le plat de culture préparés pour l'isolement spécifiques 60mm côté.
- Manipuler le dépliant pour que le côté ventricularis est face cachée sur la surface de la paraffine en laissant le côté fibrosa exposés. Epingler les bords de la notice pour exposer la couche endothéliale.
- Verser quelques gouttes de la collagénase froid sur chaque surface (à la hausse face) endothéliales et incuber les tissus pendant 5-10 minutes à 37 ° C.
- Comme avant, retirez délicatement la couche endothéliale par rotation d'un écouvillon sec stérile sur la surface de la notice. Le sens de rotation et la quantité de cisaillement appliquée est essentielle pour la pureté de votre échantillon. La rotation de l'écouvillon doit être dans une direction opposée au mouvement linéaire de votre main la création d'un cisaillement contrôlé. Ce cisaillement est ce que soulève les cellules endothéliales du tissu et rien d'autre. La quantité de force appliquée doit être suffisante pour sentir la résistance du tissu, mais ne pénètre pas dans le tissu.
- Occasionnellement, tamponnez l'écouvillon dans la solution de la collagénase pour déloger les cellules à partir des fibres pointe. Après écouvillonnage est complète, la texture de la couche endothéliale doit se sentir légèrement plus lisse qu'avant.
- Recueillir la suspension cellulaire / collagénase et le transfert dans un nouveau tube de 15 ml stérile. Indiquez une spécificité à côte sur l'étiquette (tracts de la même valve peut être mis en commun).
- Transfert des tracts à une boîte de culture nouvelle sorte que le côté ventricularis est maintenant exposée et répétez les étapes (05/03 au 05/06).
- Une fois que tous suspension cellulaire / collagénase est recueillie, centrifuger les tubes à 1000 rpm pendant 5 minutes pour culotter les cellules isolées et aspirer le surnageant. Si isoler des cellules interstitielles ainsi, effectuer ce protocole alors que ces cellules sont centrifugées.
- Ajouter 3 mL de milieu porcine endothéliales dans les tubes, centrifuger une deuxième fois, et aspirer les médias. Cette seconde centrifugation permet de filtrer certains des matériaux indésirables tels que les fibres pointe.
- Re-suspendre les cellules endothéliales centrifugé dans 5 ml de milieu porcine endothéliales et les cellules plaque dans un pré-enduites T-25 fiole avec montage (utilisez une fiole jaugée par tube de centrifugation).
- Laissez les cellules se développent au moins 2-3 jours avant de changer le support endothéliales. Cela permet de récupérer les cellules et se divisent, depuis le processus d'isolement est assez sévère. Si vous remarquez le rendement est très faible, envisager de passer à un petit flacon ou d'une plaque bien depuis adhérence cellule-cellule favorise la croissance cellulaire. N'oubliez pas de passage près confluent depuis l'inhibition de contact pourrait conduire à la transformation cellulaire.
6. Isolement des cellules interstitielles
- Remplissez un tube à centrifuger stérile de 15 ml avec 10 ml de solution de collagénase par soupape (3 feuillets).
- Après écouvillonnage les tracts des cellules endothéliales, les placer dans le tube de 15 ml appropriée avec la solution de la collagénase.
- Incuber pendant environ 12 à 18 heures (agiter délicatement si désiré).
- Mélanger délicatement le tissu dégradé avec une pipette sérologique avant la suspension de cellules / collagénase devient homogène. Cette homogénéisation contribue à fragmenter le tissu et la libération des cellules interstitielles.
- Centrifuger les tissus digérés pendant 5 minutes à 1000 rpm et aspirer le surnageant.
- Ajouter 5 ml interstitielle moyenne porcine aux tubes de 15 ml, centrifuger une deuxième fois, et aspirer le liquide surnageant.
- Re-suspendre les cellules endothéliales centrifugé dans 5 ml de milieu porcine interstitielle et la plaque de cellules dans un flacon T-75 (utiliser une fiole jaugée par tube de centrifugation).
- Laissez les cellules se développent au moins 1-2 jours avant de changer le milieu cellulaire interstitiel. Il y aura des débris de tissu beaucoup plus que les cellules endothéliales, mais qui est attendu. Les cellules devraient également croître au confluent plus vite que les cellules endothéliales en raison de la cellule de rendement et de leur nature.
7. Images représentant
Figure 1. La morphologie des cellules isolées à 2-3 jours après l'isolement. (A) VEC présentent une morphologie typique endothéliales et forment des grappes pour favoriser la croissance. (B) la morphologie du CIV est similaire à myofibroblastes qui sont généralement en forme de fuseau et uniformément répartis sur le flacon.
Figure 2. La morphologie des cellules isolées à la confluence. (A) VEC présentent une morphologie typique endothéliales qui sont généralement pavées et contacter la croissance inhibée. (B) la morphologie du CIV est similaire à myofibroblastes qui sont généralement en forme de fuseau et le contact de croissance n'est pas inhibée.
Figure 3. Les caractéristiques fonction des cellules isolées 6. (A) VEC sont associés à des niveaux élevés d'absorption de LDL acétylées (rouge). (B) CIV sont associés à de faibles niveaux d'absorption LDL acétylées.
Figure 4. Marqueurs cellulaires de cellules isolées 6. (A) phénotype CVE contribué à une coloration positive pour le facteur Willebrand (vert), bleu (noyaux). (B) phénotype VIC contribué à coloration négative facteur von Willebrand.
Figure 5. Marqueurs cellulaires des cellules isolées. (A) phénotype CVE contribué à coloration négative pour alpha SMA (vert), bleu (noyaux). (B) phénotype VIC contribué à coloration positive pour SMA alpha.
| Dissociation agent | La dissociation Technique | Cell Collection | Quantité de cellules | Cellulaire Pureté | Contamination |
| EDTA (3 mM) sans CaCl 2 | 5, 20, 60 min. CaCl 2 avant le plus | 20, 60, 120 min. avant la collecte | - | + / - | + + + |
| EDTA (6mm) sans CaCl 2 | 5, 20, 60 min. CaCl 2 avant le plus | 20, 60, 120 min. avant la collecte | + / - | + | + + + |
| Trypsine-EDTA (0,5 g / L) | 5, 10, 15 min. avant la désactivation | Moyen prélevé immédiatement | + | + | + + |
| Collagénase II (300 U / ml) | 5, 10, 15 min. avant la désactivation | Moyen prélevé immédiatement | -, +, + + | -, + +, + | + |
| Collagénase II (600 U / ml) | 5, 10, 15 min. avant la désactivation | Moyen prélevé immédiatement | +, + +, + + + | + +, + +, - | - |
Tableau 1. Résultats préliminaires d'une valvulopathie endothéliales protocoles d'isolement cellulaire.
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Discussion
Une bonne compréhension de la biologie valvulaires a été altérée par des difficultés techniques d'isolement et de culture des populations pures de cellules endothéliales valvulaires. Techniques d'isolement typiques impliquent la digestion enzymatique de la matrice sous-jacente basale ou chimique de dissociation des liaisons adhésives endothéliales 2,3. Expériences d'isolement préliminaires ont été évalués qualitativement par la variation des agents de dissociation et de périodes d'incubation. Les résultats de ces expériences ont montré que l'EDTA (ou trypsine-EDTA) incubation allant jusqu'à 60 minutes n'a pas réussi à déloger les cellules. Cependant, une digestion collagense pendant 5-10 minutes révélée efficace pour retrouver un nombre utilisable de pures cellules endothéliales valvulaires (tableau 1). Autres solutions enzymatiques ont été suggérées telles que complétant avec dispase, une métalloprotéase capables de cibler spécifiquement le collagène de type IV et la fibronectine, qui sont des composantes principales du sous-jacent matrice 4. Libéré des cellules peut être purifié grâce à un traitement supplémentaire, comme l'expansion clonale ou les méthodes de sélection magnétique 5.
Des données récentes ont suggéré que la valve aortique contient une distribution très hétérogène de types de cellules qui peuvent conduire à des difficultés lors de l'évaluation des phénotypes cellulaires. Contrairement à l'endothélium vasculaire, VEC devrait également aligner perpendiculairement à la direction d'écoulement du fluide 6. Profils transcriptionnels des VEC sont dépendantes à la fois la spécificité côté et l'environnement mécanique. Aortique par rapport endothélium côté du ventricule ont été identifiés comme ayant des phénotypes distincts endothéliales in vivo. Les profils d'expression génique suggèrent que l'endothélium sur la valve aortique secondaires est sujette à côté de la calcification, mais protégé contre l'initiation par des mécanismes inflammatoires antioxydantes 7. En présence de cisaillement, les cellules endothéliales bas gènes régulés calcifiée tels que BMP-4 et POSTN de conserver leur phénotype quiescent. Écoulement de cisaillement semble agir comme une mesure de protection pour les types de cellules endothéliales de chondro / ostéogénique différenciation, qui est une explication possible de la protection du ventricule endothéliales 8.
Isolations clonale des humains des valves aortiques pulmonaires ont suggéré un éventail de progéniteurs endothéliaux existent exprimant des quantités différentes de α-SMA, CD144 et CD31. Certains ont été montrés à la transition vers un phénotype mésenchymateux, analogue à l'EMT, spécifiquement en réponse à TGFB2 à des degrés divers 9. L'isolement clonale se révéler un moyen efficace de purifier les populations de cellules, mais choisit pour des populations spécifiques qui peuvent avoir l'unicité phénotypique qui ne sont pas généralisables. Ceci est très important pour l'endothélium de surface, comme beaucoup d'autres types cellulaires sont présents en quantités non nulles. Il s'agit notamment de cellules endothéliales circulantes, les cellules dérivées de moelle osseuse, et les monocytes, qui peut exprimer une ou plusieurs endothéliales des caractéristiques similaires à 10, 11. En outre, les isolats clonaux subissent de nombreuses divisions cellulaires pour atteindre le nombre de cellules appropriées pour des expériences, à quel point beaucoup de non-progénitrices phénotypes aura sénescence ou dédifférenciées. Par conséquent, l'isolement de cellules primaires telles que décrites ici donne la meilleure représentation de la population valve native endothéliales. Le défi sera de déterminer si des sous-phénotypes qui émergent sont intrinsèques ou sortir de réponses différentielles à des stimuli externes. Avec cette approche, on devrait être en mesure de déterminer la prévalence relative de chacun et leurs conséquences en réponse à des traitements spécifiques.
Méthodes de tri magnétique ont également fourni un moyen de purifier les populations de cellules, mais dépendent fortement des conditions d'étiquetage des anticorps et de cellules dérivées de la population. Avec les populations compréhension croissante de cellules vanne, marqueurs endothéliaux tels que CD31, CD144, et négative α-SMA ne peut pas être suffisante pour trier pour une population valvulaires pur. Isolations clonale ont prouvé que les cellules endothéliales contiennent un large éventail de l'expression du marqueur menant à d'éventuelles inexactitudes avec tri. Lorsque les cellules endothéliales ont été triées triés pour CD31, la pureté de l'échantillon est passé à près de 96%. Cependant, les cellules interstitielles ont commencé à réapparaître dans les cultures cultivées un jour après la confluence 4. Bien que le tri magnétique est une option, on doit considérer le tri des marqueurs supplémentaires et les niveaux d'expression tels que positifs pour la CAO-11 et négatif pour périostine 6.
Nous fournissons une méthode pour isoler et cultiver des populations pures de cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC). En utilisant cette méthode, un traitement supplémentaire, comme l'isolement clonale et les méthodes de sélection magnétique peut être éliminé pour atteindre une population représentative de côté spécifiques des cellules endothéliales. Cellule morphologie, les caractéristiques fonctionnelles, des marqueurs multiples, et les niveaux d'expression doivent tous être considérés lors de l'évaluation de la population.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche est soutenue par la bourse de carrière NSF, la Fondation Hartwell, et l'American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Critical Swabs | VWR international | 89031-270 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | |
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 24 Well Plate | Falcon BD | 353047 | |
| 60x15 mm Dishes | VWR international | 25384-092 | |
| 60x15 Glass Dishes | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | |
| 500 mL Nalgene Filters | VWR international | 73520-985 | |
| 1L Nalgene Filters | VWR international | 73520-986 | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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