Summary
हम अलग और हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (ग्राम शिक्षा समिति) के संवर्धन शुद्ध आबादी के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. ग्राम शिक्षा समिति के cusp या पत्रक के दोनों ओर से अलग किया जा सकता है है और तुरंत निम्नलिखित, अंतर्निहित बीचवाला सेल अलगाव (विक) सीधा है.
Abstract
हार्ट वाल्व हृदय प्रणाली के माध्यम से यूनिडायरेक्शनल रक्त के प्रवाह को बनाए रखने के लिए पूरी तरह जिम्मेदार हैं. ये पतली, तंतुमय ऊतक महत्वपूर्ण यांत्रिक तनाव के रूप में वे खुले और एक जीवन पर कई अरब बार बंद करने के लिए अधीन हैं. इन ऊतकों की अविश्वसनीय धीरज निवासी endothelial वाल्वुलर (ग्राम शिक्षा समिति) और बीचवाला कोशिकाओं के कारण है (विक) है कि लगातार मरम्मत और स्थानीय यांत्रिक और जैविक संकेतों के जवाब में फिर से तैयार है. हाल ही में हम इन कोशिकाओं की अद्वितीय व्यवहार, जिसके लिए इन विट्रो प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है समझ करने के लिए शुरू कर दिया है. विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण और ग्राम शिक्षा समिति के के अलगाव और संस्कृति है. विशेष देखभाल इस्तेमाल किया जा पल से ऊतक अंतिम चढ़ाना के माध्यम से मेजबान से निकाल दिया जाता है चाहिए. यहाँ हम प्रत्यक्ष अलगाव, ओर विशिष्ट अलगाव, संस्कृति, और ग्राम शिक्षा समिति के शुद्ध आबादी के सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम एक कोमल झाड़ू scraping तकनीक केवल सतह कोशिकाओं बेदखल द्वारा पीछा एंजाइमी पाचन का उपयोग करें. इन कोशिकाओं तो एक ट्यूब में एकत्र कर रहे हैं और एक गोली में centrifuged. गोली तो resuspended और संस्कृति बोतल में चढ़ाया मैट्रिक्स कोलेजन मैं के साथ पूर्व में लिपटे. ग्राम शिक्षा समिति के phenotype संपर्क द्वारा की पुष्टि की है विकास और PECAM1 (CD31) जैसे endothelial विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति हिचकते हैं, वॉन Willebrand (vWF) फैक्टर, और अल्फा चिकनी पेशी actin (α-SMA) के नकारात्मक अभिव्यक्ति. ग्राम शिक्षा समिति के कार्यात्मक विशेषताओं acetylated एलडीएल के उच्च स्तर के साथ जुड़े रहे हैं. संवहनी endothelial कोशिकाओं के विपरीत, ग्राम शिक्षा समिति के अद्वितीय क्षमता mesenchyme, जो सामान्य रूप से भ्रूण वाल्व एक गठन के दौरान होता है में बदलना है. यह भी इन विट्रो संस्कृति में काफी लंबे समय तक पद मिला हुआ के दौरान पाए जाते हैं, कर सकते हैं ताकि देखभाल पर या संगम के निकट पारित होने के लिए किया जाना चाहिए. ग्राम शिक्षा समिति के अलगाव के बाद, विक के शुद्ध आबादी तो आसानी से हासिल किया जा सकता है.
Protocol
1. तैयार
- एक कवर लिखत में आटोक्लेव ट्रे निम्नलिखित मदों:
- पत्रक ऊतक से निपटने के लिए - दाँतेदार ऊतक संदंश
- पत्रक ऊतक और cusps trimming के लिए ऊतक (8 सेमी) कैंची
- पत्रक या cusp से endothelial परत अलग - कपास swabs
- बाँझ collagenase समाधान बनाओ
- MΩ 18 पानी की 250 एमएल पाउडर DMEM से 4.0 ग्राम जोड़ें.
- सोडियम बिकारबोनिट का 1.11 ग्राम जोड़ें.
- (600 यू / एमएल) collagenase की 180.000 इकाइयों जोड़ें.
- 1 (3ml)% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें.
- 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें.
- 270 एमएल समाधान करने के लिए ऊपर ले आओ.
- 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा द्वारा हल जीवाणुरहित.
- बाँझ भ्रूण गोजातीय सीरम के 10% (30ml) जोड़ें.
- बाँझ endothelial सेल मध्यम बनाओ
- MΩ 18 पानी की 400 एमएल पाउडर DMEM के 6.7 ग्राम जोड़ें.
- सोडियम बिकारबोनिट का 1.85 ग्राम जोड़ें.
- (50 यू / एमएल) हेपरिन की 25,000 इकाइयों जोड़ें.
- 1% (5ml) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें.
- 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें.
- 450 एमएल समाधान करने के लिए ऊपर ले आओ.
- 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा द्वारा हल जीवाणुरहित.
- बाँझ भ्रूण गोजातीय सीरम के 10% (50ml) जोड़ें.
- बाँझ बीचवाला सेल मध्यम बनाओ
- MΩ 18 पानी की 800 एमएल पाउडर DMEM 13.37 ग्राम जोड़ें.
- सोडियम बिकारबोनिट का 3.7 ग्राम जोड़ें.
- 1% (10ml) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें.
- 7.2 करने के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें.
- 900 एमएल समाधान करने के लिए ऊपर ले आओ.
- 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा द्वारा हल जीवाणुरहित.
- बाँझ गोजातीय सीरम के 10% (100ml) जोड़ें.
2. हार्ट वाल्व पत्रक का अलगाव
- आबकारी बलिदान के बाद दिल से महाधमनी और तुरंत aseptically जड़.
- अच्छी तरह से ठंड बाँझ DPBS के साथ खून की महाधमनी जड़ कुल्ला. यह जितनी जल्दी हो सके सभी रक्त घटकों को दूर करने के लिए ग्राम शिक्षा समिति की मौत और बैक्टीरियल संदूषण की सीमा जरूरी है. एंटीबायोटिक्स और antimycotics इस स्तर पर सलाह नहीं दी क्योंकि वे संभावित ग्राम शिक्षा समिति के लिए हानिकारक हैं.
- वाल्व पत्रक (3 वाल्व प्रति) को सीधे और एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार 12 एमएल ठंड DPBS के साथ भरा ट्यूब में मूल स्थान से अलग. कई बार हिलाएँ ताजा DPBS के साथ मलबे और फिर से भरना हटायें.
- बर्फ पर प्रयोगशाला में वापस परिवहन.
- प्रयोगशाला में आगमन पर, बाँझ हुड के नीचे ऊतक के साथ कंटेनर जगह है.
3. Endothelial परत के अलगाव
- वाल्व प्रति ठंड collagenase समाधान (3 पत्रक) के 3ml के साथ एक बाँझ 35 मिमी पकवान भरें.
- 15 एमएल ट्यूब से सभी तीन पत्रक collagenase समाधान के साथ भरा डिश में रखें.
- 5-10 मिनट के लिए 37 ऊतक सेते डिग्री सेल्सियस
- धीरे पुस्तिका के सतह पर एक सूखी बाँझ झाड़ू rotating द्वारा endothelial परत को हटा दें. रोटेशन और कतरनी लागू की राशि की दिशा अपने नमूना की शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण है. झाड़ू के रोटेशन रेखीय गति अपने हाथ की एक नियंत्रित कतरनी बनाने के लिए एक विपरीत दिशा में होना चाहिए. यह कतरनी है जो ऊतकों से endothelial कोशिकाओं लिफ्टों. बल लागू की राशि के लिए ऊतक के प्रतिरोध महसूस, लेकिन तहखाने झिल्ली घुसना नहीं पर्याप्त होना चाहिए.
- कभी कभी, थपका collagenase समाधान के भीतर झाड़ू टिप फाइबर कोशिकाओं से बेदखल करने के लिए. Swabbing के बाद पूरा हो गया है, endothelial परत की बनावट थोड़ा पहले से भी अधिक चिकनी महसूस करना चाहिए.
- सेल निलंबन / collagenase लीजिए और एक नया बाँझ 15ml ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
- 1000 rpm पर ट्यूबों गोली से 5 मिनट के किसी भी अलग कक्षों के लिए और सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र aspirate. यदि बीचवाला कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से अलग है, जबकि इन कोशिकाओं centrifuged किया जा रहा है कि प्रोटोकॉल प्रदर्शन.
- Endothelial सुअर का 15 एमएल ट्यूबों के माध्यम के 3 एमएल जोड़ें, एक दूसरी बार अपकेंद्रित्र, और aspirate मीडिया. यह दूसरा centrifugation टिप फाइबर के रूप में अवांछित सामग्री के कुछ फिल्टर में मदद करता है.
- एक पूर्व लेपित कोलेजन के साथ फ्लास्क टी 25 (उपयोग अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति 1 फ्लास्क) में 5 एमएल endothelial सुअर का मध्यम और कोशिकाओं की थाली के centrifuged endothelial कोशिकाओं को पुन-निलंबित.
- चलो कोशिकाओं endothelial मध्यम बदलने से पहले कम से कम 2-3 दिन बढ़ने. यह कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और विभाजित के बाद अलगाव की प्रक्रिया काफी कठोर है और सेल उपज कम हो सकता है में मदद करता है. यह संगम के पास बीतने कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से संपर्क निषेध सेल परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व सकता है.
4. एक साइड विशिष्ट अलगाव के लिए 60 मिमी संस्कृति डिश तैयार
- रेखा एल्यूमीनियम (पन्नी के साथ 60 मिमी कांच पेट्री डिश 2 leafle प्रति गिलास व्यंजनटी). एल्यूमीनियम पन्नी के लिए पैराफिन हटाने में मदद करता है, ताकि कांच पेट्री डिश अन्य isolations के लिए reused किया जा सकता है.
- व्यंजन भीतर आयल मोती प्लेस, के बारे में आधा भरा, और autoclaving के लिए कवर.
- एक बार autoclaving पूरा हो गया है और आयल पिघल रहा है, एक शांत फ्लैट सतह पकवान पहनावा चाल है. आयल ठंडा, यह कठोर और एक परत है कि सुई punctures समर्थन करेंगे पैदा करेगा.
- 30 मिनट के बाद, निष्फल पकवान तो एक अलग कक्ष के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए पत्रक ऊतक स्थिर.
5. साइड विशिष्ट Endothelial परत के अलगाव
- 15ml और ट्यूबों तैयार साइड विशिष्ट अलगाव के लिए 60mm संस्कृति डिश पर जगह से पत्रक निकालें.
- पत्रक का हेरफेर इतना है कि ventricularis पक्ष आयल छोड़ने fibrosa पक्ष उजागर सतह पर नीचे का सामना करना है. पिन पुस्तिका के किनारों endothelial परत बेनकाब.
- प्रत्येक (ऊपर का सामना करना पड़) endothelial सतह पर ठंड collagenase की कुछ बूँदें प्लेस और 37 पर 5-10 मिनट के लिए ऊतक सेते डिग्री सेल्सियस
- जैसा कि पहले, धीरे पुस्तिका के सतह पर एक सूखी बाँझ झाड़ू rotating द्वारा endothelial परत को हटा दें. रोटेशन और कतरनी लागू की राशि की दिशा अपने नमूना की शुद्धता के लिए महत्वपूर्ण है. झाड़ू के रोटेशन रेखीय गति अपने हाथ की एक नियंत्रित कतरनी बनाने के लिए एक विपरीत दिशा में होना चाहिए. यह कतरनी है जो ऊतकों और कुछ नहीं से endothelial कोशिकाओं लिफ्टों. बल लागू की राशि के लिए ऊतक के प्रतिरोध महसूस, लेकिन ऊतक के भीतर घुसना नहीं पर्याप्त होना चाहिए.
- कभी कभी, थपका collagenase समाधान के भीतर झाड़ू टिप फाइबर कोशिकाओं से बेदखल करने के लिए. Swabbing के बाद पूरा हो गया है, endothelial परत की बनावट थोड़ा पहले से भी अधिक चिकनी महसूस करना चाहिए.
- सेल निलंबन / collagenase लीजिए और एक नया बाँझ 15ml ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण. लेबल पर पक्ष विशिष्टता (वही वाल्व से पत्रक के साथ जमा किया जा सकता है) का संकेत मिलता है.
- एक नई संस्कृति डिश पत्रक स्थानांतरण ventricularis पक्ष इतना है कि अब संपर्क में है और दोहराने कदम (5.3-5.6).
- एक बार सभी सेल निलंबन / collagenase एकत्र की है, 5minutes के लिए 1000 rpm पर ट्यूबों गोली किसी भी पृथक कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र और aspirate सतह पर तैरनेवाला. यदि बीचवाला कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से अलग है, जबकि इन कोशिकाओं centrifuged किया जा रहा है कि प्रोटोकॉल प्रदर्शन.
- Endothelial सुअर ट्यूबों के माध्यम के 3 एमएल जोड़ें, एक दूसरी बार अपकेंद्रित्र, और मीडिया aspirate. यह दूसरा centrifugation टिप फाइबर के रूप में अवांछित सामग्री के कुछ फिल्टर में मदद करता है.
- महाविद्यालय (उपयोग अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति एक फ्लास्क) के साथ एक पूर्व - लेपित टी-25 फ्लास्क में 5 एमएल endothelial सुअर का मध्यम और कोशिकाओं की थाली के centrifuged endothelial कोशिकाओं को पुन-निलंबित.
- चलो कोशिकाओं endothelial मध्यम बदलने से पहले कम से कम 2-3 दिन बढ़ने. इस में मदद करता है कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और विभाजित के बाद अलगाव की प्रक्रिया काफी कठोर है. यदि आप उपज बहुत कम होने के लिए नोटिस, एक छोटे फ्लास्क या अच्छी तरह से थाली करने के लिए आगे बढ़ के बाद से सेल कोशिका आसंजन सेल के विकास को बढ़ावा देता है पर विचार करें. संगम के पास बीतने के बाद से संपर्क निषेध सेल परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं याद रखें.
6. बीचवाला कक्ष के अलगाव
- एक बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब वाल्व प्रति collagenase समाधान (3 पत्रक) के 10 एमएल के साथ भरें.
- Endothelial कोशिकाओं के पत्रक swabbing के बाद, तुरंत collagenase समाधान के साथ उचित 15ml ट्यूब में उन्हें जगह.
- लगभग 12 से 18 घंटे के लिए सेते हैं (धीरे आंदोलन अगर वांछित).
- अपमानित ऊतक धीरे एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ जब तक सेल निलंबन / collagenase homogenized हो जाता मिक्स. यह homogenization ऊतकों को तोड़ने के लिए और बीचवाला कोशिकाओं रिहाई में मदद करता है.
- 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर पचा ऊतक और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- 15ml ट्यूबों 5 एमएल बीचवाला सुअर का मध्यम जोड़ें, एक दूसरी बार अपकेंद्रित्र, और supernate aspirate.
- बीचवाला सुअर का मध्यम और कोशिकाओं थाली में 5 एमएल में centrifuged endothelial कोशिकाओं को पुन-निलंबित एक टी-75 फ्लास्क (अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति 1 कुप्पी का उपयोग करें).
- चलो कोशिकाओं बीचवाला सेल मध्यम बदलने से पहले कम से कम 1-2 दिन बढ़ने. वहाँ बहुत अधिक के साथ तुलना endothelial कोशिकाओं है, लेकिन उम्मीद है कि ऊतक मलबे जाएगा. कोशिकाओं को भी संगम सेल उपज और उनके स्वभाव की वजह से endothelial कोशिकाओं की तुलना में तेजी से बढ़ने चाहिए.
7. प्रतिनिधि छवियाँ
चित्रा 1, 2-3 दिनों के बाद अलगाव में अलग कक्षों की आकारिकी. (ए) ग्राम शिक्षा समिति के एक ठेठ endothelial आकारिकी और विकास को बढ़ावा देने समूहों फार्म एक्ज़िबिट. (बी) विक आकारिकी myofibroblasts जो आम तौर पर आकार और कुप्पी भर में समान रूप से फैल धुरी कर रहे हैं करने के लिए इसी तरह की है.
चित्रा 2. Confluency पर अलग कक्षों की आकारिकी. (ए) ग्राम शिक्षा समिति के प्रदर्शन एक ठेठ endothelial आकारिकी जो आम तौर पर cobblestone और विकास संपर्क हिचकते हैं. (बी) विक आकारिकी myofibroblasts है जो आम तौर पर कर रहे हैं धुरी आकार और संपर्क नहीं हिचकते विकास के लिए समान है.
चित्रा 3. 6 पृथक कोशिकाओं के समारोह विशेषताओं. (ए) ग्राम शिक्षा समिति के acetylated एलडीएल तेज (लाल) के उच्च स्तर के साथ जुड़े रहे हैं. (बी) विक acetylated एलडीएल तेज के निम्न स्तर के साथ जुड़े रहे हैं.
चित्रा 4 पृथक 6 कोशिकाओं के सेलुलर मार्करों. (ए) ग्राम शिक्षा समिति के phenotype वॉन Willebrand फैक्टर (हरा), नीला (नाभिक) के लिए सकारात्मक धुंधला करने के लिए योगदान है. (बी) विक phenotype वॉन Willebrand फैक्टर के लिए नकारात्मक धुंधला हो जाना करने के लिए योगदान है.
चित्रा 5 अलग कोशिकाओं के सेलुलर मार्करों. (ए) ग्राम शिक्षा समिति के phenotype अल्फा SMA (हरा), नीला (नाभिक) के लिए नकारात्मक धुंधला हो जाना करने के लिए योगदान है. (बी) विक phenotype अल्फा SMA के लिए सकारात्मक धुंधला हो जाना करने के लिए योगदान है.
| हदबंदी एजेंट | हदबंदी तकनीक | सेल संग्रह | सेल मात्रा | सेल शुद्धता | संदूषण |
| 2 CaCl बिना EDTA (3mm) | 5, 20, 60 मिनट. 2 इसके अलावा CaCl पहले | 20, 60, 120 मिनट. संग्रह से पहले | - | + / - | + + + के |
| 2 CaCl बिना EDTA (6mm) | 5, 20, 60 मिनट. 2 इसके अलावा CaCl पहले | 20, 60, 120 मिनट. संग्रह से पहले | + / - | + | + + + के |
| Trypsin EDTA (0.5 छ / एल) | 5, 10, 15 मिनट. निष्क्रियकरण के पहले | मध्यम तुरंत एकत्र | + | + | + + |
| Collagenase द्वितीय (300 यू / एमएल) | 5, 10, 15 मिनट. निष्क्रियकरण के पहले | मध्यम तुरंत एकत्र | - + + + | - + + + | + |
| Collagenase द्वितीय (600 यू / एमएल) | 5, 10, 15 मिनट. निष्क्रियकरण के पहले | मध्यम तुरंत एकत्र | + + + +, + + | + + + +, - | - |
तालिका 1 प्रारंभिक वाल्वुलर endothelial सेल अलगाव प्रोटोकॉल का परिणाम है.
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Discussion
वाल्वुलर जीव विज्ञान की समझ तकनीकी अलग कठिनाइयों और वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं के संवर्धन शुद्ध आबादी द्वारा किया गया बिगड़ा है. ठेठ अलगाव तकनीक अंतर्निहित बेसल मैट्रिक्स या endothelial चिपकने वाला 2,3 बांड की रासायनिक वियोजन के enzymatic पाचन शामिल है. प्रारंभिक अलगाव प्रयोगों गुणात्मक हदबंदी एजेंटों और ऊष्मायन अवधि के अलग से मूल्यांकन किया गया. इन प्रयोगों के परिणामों से पता चला है कि 60 मिनट के लिए है कि EDTA ऊष्मायन (या trypsin EDTA) dislodging कोशिकाओं में असफल रहा था. हालांकि, 5-10 मिनट के लिए एक collagense पाचन शुद्ध वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं (1 टेबल) का एक प्रयोग करने योग्य संख्या को पुन: प्राप्त करने करने के लिए कारगर साबित हुआ. अन्य एंजाइम समाधान dispase, एक विशेष रूप से कोलेजन टाइप IV और fibronectin जो अंतर्निहित मैट्रिक्स 4 के मुख्य घटक हैं लक्ष्य करने में सक्षम metalloprotease के साथ सप्लीमेंट के रूप में सुझाव दिया गया है. मुक्त कोशिकाओं क्लोनल विस्तार या चुंबकीय चयन 5 तरीकों जैसे अतिरिक्त संसाधन के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है है.
हाल ही में सबूत सुझाव दिया है कि महाधमनी वाल्व सेल प्रकार जो कठिनाइयों के लिए नेतृत्व जब सेलुलर phenotypes का मूल्यांकन हो सकता है की एक बहुत ही विषम वितरण होता है. संवहनी endothelium के विपरीत, ग्राम शिक्षा समिति के भी द्रव 6 प्रवाह की दिशा को सीधा तालमेल होना चाहिए. ग्राम शिक्षा समिति के transcriptional प्रोफाइल दोनों पक्ष विशिष्टता और यांत्रिक पर्यावरण पर निर्भर कर रहे हैं. महाधमनी बनाम निलय पक्ष endothelium vivo में अलग endothelial phenotypes होने के रूप में पहचान की गई. जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल सुझाव है कि महाधमनी पक्ष वाल्व पर endothelium पत्थराना की ओर संभावना है, लेकिन antioxidative 7 तंत्र द्वारा भड़काऊ दीक्षा के खिलाफ की रक्षा . कतरनी प्रवाह की उपस्थिति में, endothelial कोशिकाओं जैसे बीएमपी 4 और POSTN नीचे calcific जीन को विनियमित करने के लिए अपने मौन phenotype बनाए रखने. कतरें प्रवाह / chondro osteogenic भेदभाव, जो निलय endothelial 8 संरक्षण के एक संभव विवरण है से endothelial सेल प्रकार के लिए एक सुरक्षात्मक उपाय के रूप में कार्य करने के लिए लगता है.
मानव फेफड़े के महाधमनी वाल्व से clonal isolations endothelial α-SMA, CD144, और CD31 के विभिन्न मात्रा में मौजूद व्यक्त progenitors के एक स्पेक्ट्रम का सुझाव दिया है. कुछ एक mesenchymal phenotype के लिए संक्रमण के लिए दिखाया गया है, EMT के अनुरूप विशेष रूप से 9 डिग्री बदलती में TGFB2 के जवाब में, . Clonal अलगाव सेल आबादी को शुद्ध करने का एक प्रभावी तरीका साबित हो, लेकिन विशिष्ट subpopulations है कि प्ररूपी विशिष्टता है कि generalizable नहीं है हो सकता है के लिए चयन करता है. यह सतह endothelium के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं अशून्य मात्रा में मौजूद हैं. Endothelial कोशिकाओं परिसंचारी, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं और monocytes, जो सभी के एक या एक से अधिक endothelial की तरह 10 विशेषताओं, 11 को व्यक्त कर सकते हैं शामिल हैं. इसके अलावा, clonal आइसोलेट्स कई सेल डिवीजनों से गुजरना प्रयोगों, पर जो बात कई गैर पूर्वज phenotypes या senesced होगा dedifferentiated के लिए उपयुक्त सेल नंबर तक पहुँचने. इसलिए, इस तरह के रूप में यहाँ वर्णित प्राथमिक सेल अलगाव देशी वाल्व endothelial आबादी का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व देता है. चुनौती का पता लगाने के लिए कि क्या उप phenotypes कि उभरने आंतरिक हैं या अंतर प्रतिक्रियाओं से बाह्य stimuli करने के लिए उभरने जाएगा. इस दृष्टिकोण के साथ, एक विशिष्ट उपचार के लिए प्रतिक्रिया में प्रत्येक और उनके परिणामों के रिश्तेदार व्यापकता को निर्धारित करने में सक्षम होना चाहिए.
चुंबकीय छँटाई तरीकों में भी सेल आबादी को शुद्ध करने का एक तरीका प्रदान की है, लेकिन अत्यधिक एंटीबॉडी लेबलिंग शर्तों और व्युत्पन्न सेल की आबादी पर निर्भर हैं. बढ़ती समझ वाल्व सेल आबादी, जैसे CD31 endothelial मार्करों, CD144, और नकारात्मक α-SMA के साथ एक शुद्ध वाल्वुलर आबादी के लिए सॉर्ट करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता. Clonal isolations से साबित कर दिया है कि endothelial कोशिकाओं मार्कर छँटाई के साथ संभव inaccuracies अग्रणी अभिव्यक्ति की एक व्यापक स्पेक्ट्रम शामिल हैं. जब endothelial कोशिकाओं सॉर्ट किया गया CD31 के लिए हल किया गया, नमूना पवित्रता लगभग 96% करने के लिए वृद्धि हुई है. हालांकि, बीचवाला कोशिकाओं एक दिन 4 - संगम के बाद हो संस्कृतियों में फिर से प्रकट होना शुरू कर दिया. हालांकि चुंबकीय छँटाई एक विकल्प है, एक जैसे सीएडी-11 के लिए सकारात्मक और नकारात्मक periostin के लिए 6 अतिरिक्त मार्करों और अभिव्यक्ति के स्तर के लिए छँटाई पर विचार करना चाहिए.
हम अलग और हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (ग्राम शिक्षा समिति) के संवर्धन शुद्ध आबादी के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं. इस पद्धति का उपयोग करके, clonal अलगाव और चुंबकीय चयन के तरीकों के रूप में अतिरिक्त संसाधन पक्ष विशिष्ट endothelial कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि जनसंख्या को प्राप्त करने के लिए समाप्त किया जा सकता है. सेल आकारिकी, कार्यात्मक विशेषताओं, कई मार्करों, और अभिव्यक्ति के स्तर को सभी जब जनसंख्या का आकलन माना जाना चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध NSF कैरियर पुरस्कार, Hartwell फाउंडेशन, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (# 0830384N) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 50-103-PB | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300-058 | |
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Critical Swabs | VWR international | 89031-270 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | |
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | |
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| 24 Well Plate | Falcon BD | 353047 | |
| 60x15 mm Dishes | VWR international | 25384-092 | |
| 60x15 Glass Dishes | VWR international | 89000-310 | |
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | |
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | |
| 500 mL Nalgene Filters | VWR international | 73520-985 | |
| 1L Nalgene Filters | VWR international | 73520-986 | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | |
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
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