Summary
En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo HH14
Abstract
Formación adecuada y la función de las válvulas del corazón embrionario es crítica para la progresión del desarrollo. El corazón embrionario temprano es un tubo en forma de U del endocardio rodeado de miocardio. El miocardio secreta gelatina cardíaca, una matriz rica en ácido hialurónico gelatinosa, en el nódulo auriculoventricular (AV) y el tracto de salida (OFT) del lumen. En la etapa HH14 valvulogenesis comienza cuando un subconjunto de las células endocárdicas, recibir señales de miocardio, endocardio someterse a la transformación de mesenquimales (EMT), e invadir la gelatina cardíaca. En la etapa HH25 los cojines son totalmente valvular mesenchymalized, y esto es lo que finalmente mesénquima forma el aparato valvular y del tabique del corazón. Comprensión de los mecanismos que inician y modulan el proceso de diferenciación celular y la EMT son importantes debido a su conexión con graves defectos congénitos del corazón. En este estudio se presentan los métodos para aislar pre-EMT endocárdica y después de la EMT células mesenquimales, que son los dos diferentes fenotipos de células del cojín prevalvular. Pre-EMT endocardial células pueden ser cultivadas con o sin el miocardio. Después de la EMT células mesenquimales colchón AV pueden ser cultivadas en el interior mecánicamente restringido o sin estrés geles de colágeno. Estas 3D en modelos in vitro imitar los principales eventos morfogénicos valvular y son útiles para la deconstrucción de los mecanismos de valvulogenesis etapa temprana y tardía.
Protocol
1. Preparación
- Incubar codorniz fértiles o huevos de gallina para la 14 ª etapa - (alrededor de 2 días) o 25 (alrededor de 4,5 días) en 60% de humedad y 37 º C.
- Prepare la solución de Earl estéril de salina balanceada (EBSS)
- Añadir 100 ml EBSS 10 veces a 600 ml de agua 18 mW
- Añadir 2,2 g de bicarbonato sódico
- Ajustar el pH de la solución a 7,2
- Llevar la solución a 1000 ml
- Esterilizar la solución al pasar por un filtro de 0,2 micras
- Prepare estéril M199 medio de cultivo.
- Añadir un paquete de polvo de M199 a 700 ml de agua 18 mW.
- Añadir 2,2 g de bicarbonato sódico
- Ajustar el pH de la solución a 7,2.
- Agregar 10 ml (1%) penicilina-estreptomicina
- Llevar la solución a 1000 ml
- Esterilizar la solución al pasar por un filtro de 0,2 micras
- Añadir 1 ml estéril 100X insulina-transferrina-selenio-G suplemento
- Agregar 10 ml (1%) de suero de pollo estéril
- Prepare tres dimensiones geles de colágeno a una concentración de colágeno de 1,5 mg / ml. Trabajos anteriores en nuestro laboratorio han demostrado que una concentración de colágeno de más de 1,5 mg / ml proporciona una matriz que es demasiado rígido biomecánicamente para que las células se mueven a través. Las concentraciones de gel de colágeno inferior a 1,5 mg / ml tienen las fibras de colágeno tan pocos que el grupo de células se pueden triturar las fibras a nivel local, produciendo una isla de las células.
- Agregue el siguiente heladas reactivos a un tubo de centrífuga estéril 15 ml con el fin de:
- 3X M199: Volumen = volumen total necesario / 3
- Estéril 18 mW de agua: Volumen = volumen total necesario (M199 volumen + volumen suero de pollo + 0,1 M NaOH + volumen de volumen de colágeno)
- Suero de pollo estéril: Volumen = volumen total necesario * 0.01
- Rata cola de colágeno I: Volumen = (concentración de gel de colágeno * volumen total necesario) / colágeno concentración de las
- Estéril 0,1 M de NaOH: Volumen = volumen de colágeno * 0,2
Nota: La cantidad de agua, 0,1 M NaOH, y el colágeno añadido variará dependiendo de la concentración de la solución de colágeno.
- Mezclar la solución de colágeno y con una pipeta estéril.
- Inmediatamente la transferencia de 0,3 ml de la solución de colágeno en 1,9 cm 2 pozos de crecimiento de la zona. Esta es la solución de colágeno suficiente para cubrir completamente el bien y para proporcionar un gel que es de aproximadamente 3 mm de espesor. Un espesor de gel de al menos 250 micras es necesario para los estudios de la invasión celular.
- Deje que la solución de colágeno a gel por lo menos durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2, y 100% de humedad.
- Agregue el siguiente heladas reactivos a un tubo de centrífuga estéril 15 ml con el fin de:
2. Pre-EMT endocárdica aislamiento de células y Cultura
- Embrión de aislamiento
- Coloque una pieza de pulgada de largo de la cinta de laboratorio en el extremo más grande del huevo. Aquí es donde la cámara de aire se encuentra. La cinta se estabiliza la frágil cáscara de huevo de codorniz.
- Suavemente la punción de la zona grabada del huevo en la cámara de aire con la punta de esterilizar tijeras curvas.
- Corte un agujero en la parte grabada de un huevo, que es lo suficientemente grande como para permitir que la yema de pasar a través. Iniciar el agujero en la perforación y corte hacia el exterior en forma de espiral. Asegúrese de cortar a través de la membrana externa, pero evite perforar la yema de huevo.
- Cuando el agujero en la capa está completa, visualizar el embrión de codorniz. El embrión se encuentra normalmente en la parte superior de la yema.
- Comenzar a verter la yema a través del corte agujero en el huevo con una mano. Mantenga una pinza 55 en la otra mano. A medida que el embrión sale del huevo en la parte superior de la yema, deslice suavemente las pinzas # 55 en el embrión y sacarlo de la yema. Nota: Para los huevos de gallina, el aislamiento de embriones consiste en descifrar el huevo de gallina en una superficie fuerte, limpio y romper el huevo en un plato de Petri de 100 mm. El embrión debe estar ubicado en la parte superior de la yema. Deslice suavemente # 55 pinzas en el embrión y sacarlo de la yema.
- Lugar al embrión en un 100 mm placa de Petri que contiene el hielo frío, EBSS estéril.
- Etapa los embriones de acuerdo con los criterios de Hamburger y Hamilton 1. Embriones en la etapa 14 - se encuentran en estadio últimos 13, pero aún no en la etapa 15, con 20-21 somitas y una yema de cola. Una característica clave de la 14 ª etapa - los embriones es el ángulo de la cabeza, que es ligeramente superior a 90 º con el cuerpo.
- Quitar el corazón a partir de embriones de codorniz en la etapa 14 - el n º 55 pinzas de corte transversal donde el canal AV y OFT en contacto con la pared torácica. Coloque los corazones en un lado de la placa de Petri.
- Recoge los corazones aislados con una pipeta de transferencia estéril y se colocan en un nuevo plato de 100 mm de Petri llenas de estériles, helada EBSS.
- Cortar el OFTs y canales AV transversal de los ventrículos por el n º 55 pinzas.
- La sección de los canales restantes AV y / o tractos de salida (OFTs) longitudinalmente.
- Establecer una pipeta un volumen de 20 uL. Use esta pipeta para aspirar seis longitudinal de corte canales AV y OFTs.
- Expulsar a los canales de AV y OFTs en el gel de colágeno. Aspirar cualquier EBSS el exceso de la superficie del gel.
- Use # 55 pinzas para orientar a los explantes de lo que son planas y por lo tanto el lado del lumen se enfrenta el gel de colágeno. Trate de no perforar el gel de colágeno con las pinzas.
- Después de 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, quite el miocardio de los explantes por el n º 55 pinzas. Las células endocárdicas debe quedarse atrás en la superficie del gel de colágeno. Por otra parte, el miocardio se puede dejar en el explante. Con la quita de miocardio, las células del endocardio con no someterse a EMT, sin intervención. Con el miocardio presentan un subconjunto de las células endocárdicas, se transformará en mesénquima, pero el grado de transformación puede ser modulada a factores externos. Nota: Aunque el miocardio se quedará en el explante se debe permitir por lo menos 2 horas para insertarse en el gel antes de medio, se añade.
- Añadir 0,4 ml de medio M199 explantes cada uno, así que lo contiene.
- Cultivo de las células a 37 ° C, 5% de CO 2, y 100% de humedad.
3. Después de la EMT AV aislamiento Cojín de células mesenquimales y Cultura
- Romper el huevo de gallina en una superficie fuerte, limpio y romper el huevo en un plato de Petri de 100 mm. El embrión debe estar ubicado en la parte superior de la yema. Levante el embrión con # 5 pinzas por el acaparamiento de las membranas que rodean al embrión y luego colocar el embrión en un 100 mm placa de Petri llena, heladas EBSS estéril.
- Etapa los embriones de acuerdo con los criterios de Hamburger y Hamilton 1. Características de una etapa de 25 embriones son diferentes codo y articulaciones de la rodilla y la pigmentación ocular leve.
- Aislar a los corazones de todos los embriones HH25 y colocar el corazón en un lado de la placa de Petri.
- Recoge los corazones aislados con una pipeta de transferencia estéril y se colocan en un nuevo plato de 100 mm de Petri llenas de estériles, helada EBSS.
- Aislar a la región AV de todos los corazones a la vez. Coloque la AV en un lado de la placa de Petri. Agitar suavemente la región AV para quitar toda la sangre, que pueden afectar la viabilidad celular.
- Recoge los aislados AV con una pipeta de transferencia estéril y se colocan en un nuevo plato de 100 mm de Petri llenas de estériles, helada EBSS.
- Secuencialmente aislar a los cojines de la AV. Asegúrese de que no hay presencia de miocardio en los cojines de AV.
- Recoger los cojines aislados con una pipeta de transferencia estéril y se colocan en un tubo de centrífuga estéril 15 ml.
- Girar los cojines de la parte inferior del tubo de centrífuga de 15 g durante 3 minutos.
- Utilice una punta estéril 1.000 ml para eliminar la mayor cantidad de sobrenadante EBSS como sea posible sin molestar a los cojines.
- Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA que ha sido pre-calentado a 37 ° C. Permita que los cojines para la incubación de la tripsina hasta que se disuelva por completo, lo cual es normalmente alrededor de 3-5 minutos.
- Añadir 100 ml de suero de pollo al tubo de centrífuga para saciar la tripsina.
- Que sedimenten las células a 160 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante con una punta estéril, l 1000.
- Resuspender las células en 2 ml de medio M199 y mezclar con la pipeta. Tomar 10 l de la suspensión celular a contar con hemocitómetro y determinar el número total de células que han sido aislados
- Determinar el número de geles de colágeno se hará en función del número de células aisladas. Las células necesitan para ser recubierto con una densidad de 2 x 10 5 células / ml con un volumen de 250 l de gel.
- Que sedimenten las células a 160 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante con una punta estéril, l 1000.
- Utilizando el protocolo mencionados, añadir 3X M199, agua, suero de pollo, el colágeno, y 0,1 M de NaOH, en ese orden, para el pellet de células. Mezclar por pipeteo suave.
- Añadir 250 l de cada área de crecimiento de 1,9 cm 2 también.
- Deje que la solución de colágeno a gel por lo menos durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2, y 100% de humedad.
- Añadir 0,4 ml de medio de cultivo e incubar durante la noche.
- Para continuar con el cultivo de los geles en condiciones de estrés, liberar a los geles de los lados de la cultura y con una punta de la pipeta estéril 200 mL. Culturas limitado mecánicamente son geles que se mantienen unidos a los lados de la cultura también.
4. Resultados representante
Figura 1:. Ejemplos de embriones (A) embrión HH14-codorniz, y (B) HH25 embrión de pollo se muestran aquí.
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Figura 2: HH14-válvula de explantes endocárdica después de 2 horas de cultivo (A) con el presente miocardio, o (B) con el miocardio eliminado..
Figura 3:. HH14 válvulas endocárdicas explantes (A) Con la presente miocardio, muchas de las células se someten a la transformación del endocardio y mesenquimales tienen una forma de huso, fenotipo mesenquimal después de 48 horas de cultivo. (B) Cuando el miocardio se elimina todas las células de mantener un adoquín en forma de fenotipo endocárdica después de 48 horas en la cultura.
Figura 4:. Células HH25 las células mesenquimales de la válvula en un gel de colágeno se redondean inmediatamente después de la siembra.
Figura 5:. HH25 células mesenquimales en cultivo (A) Después de 48 horas de cultivo en un gel de colágeno limitado el HH25 células mesenquimales están empezando a extenderse. (B) HH25 células en un gel de colágeno y libre de estrés siete días después de la siembra y 6 días después de la liberación han compactado el gel a aproximadamente el 50% de la superficie original.
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Discussion
El método para aislar células del endocardio de la etapa HH14 - corazones desarrollado originalmente por Runyan y Markwald proporciona un entorno controlado, en el entorno in vitro para estudiar los factores que inician y modular embrionarias EMT 2. HH14 - explantes cultivados sin endocardio miocardio no someterse a EMT, sin intervención biomecánicas o bioquímicas. Si el miocardio se deja en el explante se dará la señal de un subconjunto de las células endocárdicas, a sufrir una transformación mesenquimales, pero factores externos pueden regular este proceso. Aislamiento de células embrionarias progenitoras mesenquimales de HH25 válvula AV cojines usando el método descrito por Butcher et al. Ofrece la oportunidad de determinar lo que las señales de impulso hacia la diferenciación de células maduras valvular intersticial 3. Cultivando las células en las condiciones de esfuerzos mecánicos o libre de estrés permite a los investigadores para probar los estímulos biomecánicos, y los factores añadidos al medio de cultivo puede proporcionar señales bioquímicas. En los modelos in vitro que ayudan a descifrar los mecanismos que afectan a la EMT, la diferenciación celular, y la remodelación estructural se puede utilizar para comprender mejor las causas de defectos congénitos del corazón y podría ayudar a determinar maneras de conducir las células madre hacia la madurez fenotipos de células de la válvula para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación es apoyada por la Fundación Hartwell, la Asociación Americana del Corazón (Desarrollo Científico Subvención # 0830384N) y la Fundación Leducq: 07CVD04 mitral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dumont tweezers #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14098 | |
| Sterile transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | |
| 4-well culture plates | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane | Nalge Nunc international | 566-0020 | |
| Sterile 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm | VWR international | 25384-342 | |
| Laboratory tape | VWR international | 89097-920 | |
| Rat-tail collagen I | BD Biosciences | 354236 | |
| 10X Earl’s Balanced Salt Solution | Quality Biological, Inc. | 119-064-131 | |
| M199 powder | Invitrogen | 31100-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Chicken serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide solution, 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Fertile quail eggs (Coturnix coturnix) | Lake Cumberland Game Bird Farm | ||
| Fertile chicken eggs (Gallus gallus) | Cornell University Poultry Farm |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).
- Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase. Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).
