Summary
تم التعرف على الخلايا الجذعية السرطانية (CSCS) في عدد من الأورام الخبيثة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة الاستفادة من تدفق cytometric ألدهيد نازعة النشاط والتعبير CD44 CD24 وعزل من الإنسان CSCS xenografts غدية البنكرياس. ويمكن بعد هذه الخلايا قادرة على البقاء يمكن استخدامها في الدراسات الفنية والتحليلية.
Abstract
تم التعرف على الخلايا الجذعية السرطانية (CSCS) في عدد متزايد من الأورام الخبيثة ويتم تعريف وظيفيا من خلال قدرتها على الخضوع لتجديد الذات وإنتاج ذرية متباينة 1. هذه الخصائص تسمح CSCS أن ألخص الورم الأصلي عند حقنه في الفئران المناعة. وكان أول وصف CSCS داخل الورم الخبيث الظهارية في سرطان الثدي وجدت لعرض محددة المستضد السطحي التعبير الخلية (CD44 + CD24 / منخفضة --) 2. منذ ذلك الحين ، تم تحديد CSCS في عدد متزايد من الأورام الخبيثة الأخرى باستخدام الإنسان CD44 CD24 وكذلك عدد من مستضدات السطحية الأخرى. كما تم الخصائص الفسيولوجية ، بما في ذلك النشاط ألدهيد (ALDH) نازعة ، وتستخدم لعزل CSCS من الأنسجة الخبيثة 3-5.
مؤخرا ، حددنا وغيرها من CSCS غدية البنكرياس على أساس النشاط ALDH والتعبير عن مستضدات سطح الخلية وCD44 CD24 ، CD133 و 6-8. هؤلاء السكان قد مكون للأورام للغاية أو لا تكون متداخلة وعرض وظائف أخرى. وجدنا أن ALDH + و + CD44 + CD24 هي مكون للأورام البنكرياس CSCS بالمثل ، ولكن ALDH + الخلايا هي أكبر نسبيا الغازية 8. في هذا البروتوكول وصفنا وسيلة ناجعة لعزل من البنكرياس CSCS المنخفضة مرور xenografts الإنسان 9. ويتم حصاد Xenografted الأورام من الفئران وجعلها في تعليق وحيد الخلية. يتم فصل الأنسجة والحطام الخلايا الميتة من خلايا حية والملون ثم استخدام أجسام مضادة ضد CD44 CD24 وواستخدام كاشف ALDEFLUOR ، ركيزة من الفلورسنت ALDH 10. ثم يتم عزل CSCS بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز. ويمكن عندئذ أن تستخدم CSCS معزولة عن المقايسات التحليلية أو وظيفية تتطلب خلايا قابلة للحياة.
Protocol
1. Xenografts الحصاد من الفئران
- تعد الخلية تفارق العازلة : Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، البنسلين ، الستربتوميسين ، 200 U / مل كولاجيناز الرابع نوع ، و 0.6 dispase يو / مليلتر.
- والموت الرحيم وathymic (نو + / + نو) الماوس بايواء سرطان البنكرياس الإنسان طعم أجنبي تحت الجلد التي هي أقل من 1 سم في القطر أكبر خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم.
- حصاد الورم تحت الجلد من الجهة من الفأرة التي تشريح حادة باستخدام ملقط ومقص ووضعها مباشرة في الخلية تفارق العازلة.
- يتم وزن الأورام وضعها مرة أخرى في 10 مل الخلية تفارق العازلة لكل 1 غرام من الأنسجة السرطانية.
2. إنشاء خلية واحدة تعليق من Xenografts
- العمل في مجال السلامة الأحيائية حكومة عقيمة ، يتم نقل الورم إلى 100 x 20 مم طبق الثقافة مع 1 مل من تفكك خلية العازلة. ومفروم ميكانيكيا الأورام باستخدام شفرات الحلاقة وملقط معقم. هو مسحوق تعليق الخلية السرطانية من خلال الماصة 5 مل المصلية 10 مرات. وينبغي أن تكون القطع ورم صغير لا يكفي ليسد الماصة 5 مل المصلية.
- يتم نقل الخلايا السرطانية لتعليق أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على حجم ما تبقى من الخلايا تفارق العازلة (شغل أقل من 50 ٪) وvortexed في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
- ومن ثم حضنت تعليق خلية الورم في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع vortexing متقطعة لمدة 1 دقيقة كل 20 دقيقة.
3. تستنفد تعليق خلية من خلايا الأنسجة والحطام الميت
- بعد حضانة 2 ساعة vortexed تعليق الخلية في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
- ثم يتم تمرير تعليق خلية من خلال فلتر 70 ميكرون ، والتي تم جمعها في أنبوب 50 مل الطازجة المخروطية وتعديلها إلى الحجم النهائي من 15 مل في أنبوب.
- لمزيد من الخلايا قادرة على البقاء منفصلة من الخلايا الميتة وبقايا الأنسجة ، ويتم فصل تعليق ورم الخلايا بواسطة الطرد المركزي كثافة استخدام Ficoll - Paque بلس. يتم إنشاء السفلية من Ficoll - Paque بلس من خلال pipeting 15 مل من Paque - Ficoll ببطء زائد دون تعليق الخلية والحرص على عدم الخلط بين طبقتين.
- ويتم طرد تعليق الخلية وطبقات في Ficoll ز 500x لمدة 30 دقيقة مع فرامل إيقاف.
- يتم جمع الخلايا في واجهة من زائد Ficoll - Paque والخلية العازلة تفارق ونقل إلى أنبوب 50 مل الطازجة المخروطية.
- DMEM جديدة تستكمل مع FCS 10 ٪ إضافة إلى تعليق الخلية لأنها تضعف 01:03 (على سبيل المثال وسائل الإعلام 20 مل جديدة تضاف إلى 10 مل من التعليق الخلية).
- يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في ز 450X لمدة 10 دقائق ، ووسائل الإعلام مصبوب ، وبيليه معلق الخلية في 1 مل من ALDEFLUOR العازلة.
- غير المخفف microliters عشرة لتعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر التريبان الأزرق وخلايا قابلة للحياة تحسب باستخدام عدادة الكريات. إذا لاحظ عدد كبير من الخلايا الميتة أو الأنسجة الحطام خلال هذه الخطوة ، ومن ثم يمكن تكرار فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي الكثافة (الخطوات 3،3-3،7).
4. وصمة عار للخلايا الإسفار الفرز الخلية المنشط
- التسمية seven 12 × البوليسترين أنابيب الاختبار 75 ملم على النحو التالي :
- طاهر
- CD44 - APC
- CD24 - PE
- الماوس CD31 - البيوتين + الفأرة النسب ، البيوتين + ماوس H - 2Kd - البيوتين
- ALDEFLUOR
- + + ALDEFLUOR دياب مفتش 2bκ - APC + مفتش 2aκ - PE
- ALDEFLUOR + CD44 + CD24 - APC - PE - CD31 + ماوس + ماوس البيوتين البيوتين النسب - H - + ماوس 2Kd - البيوتين.
- تمييع تعليق خلية في 2 مل من العازلة ALDEFLUOR إلى تركيز النهائي من 5-10 مليون خلية / مل والحفاظ على الجليد. إضافة 100 ميكرولتر لتعليق الخلية لأنابيب # 1 ، 2 ، 3 و 4 والاحتفاظ بها على الجليد. إضافة 1 ميكرولتر دياب إلى أنبوب # 6 والحفاظ على الجليد. إضافة كاشف ALDEFLUOR إلى تعليق الخلايا المتبقية المخفف 1000 -- أضعاف (مثل إضافة كاشف ALDEFLUOR 1.6 إلى 1.6 مل ميكرولتر تعليق الخلية) ، ومزيج جيد ، ومكان على الجليد. نقل 100 ميكرولتر من هذا الخليط لأنابيب # 5 و 6 ، والخليط المتبقي (1.4 مل) إلى أنبوب # 7. احتضان كل من الأنابيب في المياه 37 درجة مئوية لمدة الحمام 40 دقيقة. مزيج تعليق خلية كل 10 دقائق وذلك لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي من الأنابيب.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 و 5 في 100 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. لأنابيب # 2 ، 3 ، 4 ، و 6 ، إضافة 100 ميكرولتر من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة المناسبة المخفف على النحو التالي : 1:20 لمفتش 2bΚ - APC ، مفتش 2aΚ - PE ، CD44 APC ، وCD24 - PEالأضداد ؛ 1:100 للماوس CD31 - البيوتين ، الفأرة النسب ، البيوتين ، والفأرة - H - 2Kd البيوتين الأضداد. إلى أنبوب # 7 إضافة 1.4 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على التخفيف من APC 01:20 - CD44 ، وأضداد CD24 - PE والتخفيف من الماوس 1:100 CD31 - البيوتين ، الفأرة النسب ، البيوتين ، والفأرة - H - 2Kd البيوتين الأجسام المضادة. احتضان الايقاف الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 5 ، و 6 في 100 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. إعداد 1.5 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على التخفيف من 1:100 streptavidin - PerCP البروتين. إضافة إلى أنبوب ميكرولتر 100 # (4) وإضافة 1.4 مل إلى أنبوب # 7. احتضان الايقاف الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، و 6 في 200 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. Resuspend الكرية في أنبوب # 7 في 2.8 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل يوديد propidium. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات.
- تمر الخلايا من خلال 35 ميكرون التصفية باستخدام 12 × البوليسترين أنابيب الاختبار 75 ملم مع قبعات مصفاة.
5. عزل الخلايا الجذعية السرطانية بواسطة الإسفار الفرز الخلية المنشط
- ويتم إعداد تدفق عداد الكريات FACSAria لفرز الخلايا.
- يتم وضع ضوابط التعويض باستخدام خلايا من أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، و 5.
- يتم إنشاء بوابات استنادا إلى الأمام والمعلمات الجانبية مبعثر لجمع singlets الخلية.
- غير الماوس (PerCP سلبية) وقابلة للحياة الخلايا (غير ملطخة يوديد propidium) هي بوابات باستخدام قناة FL - 3.
- يتم جمع ALDH + الخلايا استنادا البوابات التي تم إنشاؤها باستخدام الخلايا المعالجة دياب (أنبوب # 6) وFL - 1 قناة.
- يتم جمع CD44 CD24 + + الخلايا استنادا البوابات التي تم إنشاؤها باستخدام الخلايا ملطخة ALDEFLUOR ، مفتش 2bΚ - APC ، و IgG 2aκ - PE (أنبوب # 6) باستخدام FL - 4 وقنوات FL - 2.
- يتم جمع الخلايا في 12 × 75 ملم أنابيب اختبار تحتوي على البوليسترين 1 مل من DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪.
- بعد أن تم فرز الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي للتعليق على الخلية ز 450X لمدة 10 دقيقة ، صب وسائل الإعلام ، وresuspend الخلايا في DMEM 500 ميكرولتر جديدة تستكمل مع FCS 10 ٪.
- حساب عدد الخلايا فرزها باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح في الخطوة 3.8.
6. ممثل النتائج
وسوف يؤدي هذا البروتوكول إلى عزل ALDH + و + CD44 CD24 + CSCS البنكرياس. النسبة المئوية للخلايا فأر المستمدة من هو متغير ، ولكن وجدنا أن معظم xenografts الإنسان بسرطان البنكرياس تحتوي على 20-60 ٪ خلايا فأر المستمدة من استخدام الماوس CD31 ، الفأرة النسب الكوكتيل ، والفأر H - 2Kd البيوتين ، مترافق الأضداد (الشكل 1A ). وبالمثل تردد كل من السكان CSC xenografts المختلفة هو متغير ، ولكن عموما لدينا وجدت أن 1-4 ٪ من مجموع السكان الخلية هو ALDH + (الشكل 1B) و 0،2-5 ٪ هو CD44 CD24 + + (الشكل 1C).
نحن عادة العد يدويا باستخدام الخلايا فرز عدادة الكريات منذ التهم غالبا ما تكون آلة FACSAria غير دقيقة بسبب عدم الكشف عن الجزيئات الخلوية من قبل FACSAria.
الشكل 1. تدفق مؤامرة الخلوي تصور محدد من السكان البنكرياس سرطان طعم أجنبي (A) خلايا تلطيخ ايجابيا في القناة FL - 3 (propidium يوديد + ، CD31 ماوس الفأرة النسب + + ، أو الماوس H - 2Kd +) مستبعدة وذلك لعزل فقط غير قابل للاستمرار والفأر الخلايا المشتقة. (ب) وقد تم قياس النشاط في ALDH طعم أجنبي سرطان البنكرياس الإنسان التدفق الخلوي باستخدام كاشف ALDEFLUOR في حضور وغياب المانع ALDH1 diethylamino - بنزيلديهايد (دياب). الأطر تمثل البوابات التي تصور خلايا + ALDH التي تم إنشاؤها على أساس الخلايا تعامل مع دياب ومن ثم تطبيقها على الخلايا غير المعالجة. وتظهر النسب المئوية للخلايا + ALDH في البوابة. (C) وCD44 CD24 + + تم إنشاء بوابة على أساس الخلايا ملطخة ALDEFLUOR ، والأجسام المضادة للمفتش 2bκ - APC (التحكم عن الأنماط الإسوية APC - CD44) و IgG 2aκ - PE (التحكم عن الأنماط الإسوية PE - CD24). وتظهر النسب المئوية للخلايا CD44 CD24 + + في البوابة.
Discussion
يصف هذا البروتوكول عزلة CSCS البنكرياس من xenografts الإنسان. والعديد من الخطوات الرئيسية في هذا الإجراء يعزز غلة CSCS قابلة للحياة. الانتعاش من السكان نقية من البنكرياس CSCS يعتمد على نقاء خلايا قابلة للحياة موجودة في الخلية قبل التعليق على FACSAria الفرز. مع الحرص على استخدام xenografts التي هي أقل من 1 في سم بقطر أكبر يساعد على تقليل كمية الأنسجة نخرية في مركز الورم. بالإضافة إلى ذلك ، أوزون تعليق خلية من خلايا الأنسجة والحطام بالرصاص خلال الطرد المركزي المتدرج Ficoll - Paque أمر بالغ الأهمية ويمكن أن يتكرر إذا تم الكشف عن عدد كبير من الحطام الأنسجة أو الخلايا غير قابلة للتطبيق عندما يتم الاعتماد على الخلايا على عدادة الكريات.
وصف بروتوكول تلطيخ هنا يستخدم نظام كاشف ALDEFLUOR للكشف عن النشاط ALDH فضلا عن الأجسام المضادة ، مترافق fluorophore محددة للكشف عن مستضدات سطح الخلية. يتم تنفيذ ALDEFLUOR تلطيخ عند 37 درجة مئوية ، وبالتالي يجب أن تكتمل قبل تلوين الأجسام المضادة (على الجليد) لمنع المحتملة لجسم السد ، الذي يمكن أن يحدث عند 37 درجة مئوية. منذ الخلايا يمكن أن هروب رأس المال الكاشف ALDEFLUOR ، فمن المهم للحفاظ على الخلايا في ALDEFLUOR العازلة عند 4 درجة مئوية وقد تم الانتهاء بعد تلطيخ ALDEFLUOR. المخزن يحتوي على مثبط ALDEFLUOR المخدرات هروب رأس المال الذي يساعد على الحفاظ على مستويات الخلايا من ALDEFLUOR.
هذا الأسلوب يمكن أن يعزل منذ CSCS البنكرياس قابلة للحياة يمكن تطبيقها في عدد من التجارب لقياس وظيفة فسيولوجية من هذه الخلايا. وقد استخدمنا هذه الخلايا عن الورم بدء فحوصات المناعة التي تستخدم الفئران في المختبر والخلية المقايسات الهجرة / الغزو. وعلاوة على ذلك ، يمكن جمعها الجيش الملكي النيبالي ، الحمض النووي ، والبروتين من هذه الخلايا لإجراء دراسات تحليلية مقارنة ديوان الخدمة المدنية والسكان غير CSC.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (CA127574 ، وCA107040 CA09071) لWM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Fetal calf serum | Harlan Laboratories | BT-9501 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | |
| 100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | |
| 50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies | 01700 | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| 12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | |
| CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | |
| Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | |
| Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec | 130-092-613 | |
| Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | |
| IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | |
| IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | |
| Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |
References
- Clarke, M. F. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66, 9339-9344 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 3983-3988 (2003).
- Ginestier, C. ALDH1 Is a Marker of Normal and Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome. Cell stem cell. 1, 555-567 (2007).
- Jones, R. J. Circulating clonotypic B cells in classic Hodgkin lymphoma. Blood. 113, 5920-5926 (2009).
- Matsui, W. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance. Cancer Res. 68, 190-197 (2008).
- Li, C. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67, 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell stem cell. 1, 313-323 (2007).
- Rasheed, Z. A. Prognostic significance of tumorigenic cells with mesenchymal features in pancreatic adenocarcinoma. J Natl Cancer Inst. 102, 340-351 (2010).
- Rubio-Viqueira, B. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 12, 4652-4661 (2006).
- Jones, R. J. Assessment of aldehyde dehydrogenase in viable cells. Blood. 85, 2742-2746 (1995).
