人胰腺癌移植瘤的干细胞的分离

Summary

癌症干细胞（CSCS）已确定在一些恶性肿瘤。在这个协议中，我们描述了一个流式细胞仪方法，利用醛脱氢酶活性和CD44和CD24的表达，从人胰腺癌移植瘤的社区体育会隔离。然后可以使用这些活细胞功能和分析研究。

Abstract

在越来越多的恶性肿瘤和癌症干细胞（CSCS）已确定在功能上进行自我更新的能力，并产生有区别的后代¹的定义。这些特性使社区体育重述注射到免疫功能低下小鼠时，原发肿瘤。社区体育会内上皮恶性肿瘤首次描述在乳腺癌和发现，以显示特定的细胞表面抗原的表达^（CD44 + ^CD24低/ - ^）2 。从那时起，社区体育会已确定在其他人类恶性肿瘤，使用CD44和CD24以及其他表面抗原的数量越来越多。生理特性，包括醛脱氢酶（ALDH）的活性，也被用来隔离恶性组织^3-5个社区体育会。

最近，我们和其他人发现胰腺癌社区体育会的基础上乙醛脱氢酶的活性和表达的细胞表面抗原CD44和CD24和CD133的^6-8。这些高致瘤性的人口可能会或可能不会重叠和显示等功能。我们发现，ALDH ⁺和CD44 ⁺ CD24 ⁺胰腺癌社区体育会是同样的致瘤性，但ALDH ⁺细胞是相对更侵入^8。在这个协议中，我们描述了从低通过人类异种移植的方法来隔离可行的胰腺癌社区体育。从小鼠移植瘤肿瘤收获，并制作成单细胞悬液。组织碎片和死细胞是从活细胞分离，然后使用抗CD44和CD24抗体和使用ALDEFLUOR试剂，乙醛^脱氢酶 10的荧光底物染色。社区体育会是由荧光激活细胞分选分离。隔离的社区体育会，然后可以用于活细胞检测分析或功能的要求。

Protocol

1。收获从小鼠移植瘤

1. 准备细胞解离缓冲液：贝科的改良Eagle培养基（DMEM），辅以10％小牛血清（FCS），青霉素，链霉素，200 U / mL胶原酶IV型，和0.6 U / mL的dispase。
2. 一个裸鼠（NU + / NU +）窝藏皮下人胰腺癌移植瘤，是最大的直径小于1厘米的鼠标是安乐死二氧化碳窒息和颈椎脱位。
3. 皮下肿瘤是收获从鼠标的侧面使用镊子和剪刀钝清扫，放置在细胞分解缓冲区立即。
4. 肿瘤称重，每1克肿瘤组织放入10 mL细胞解离缓冲。

2。生成的移植瘤单细胞悬液

1. 在无菌的生物安全柜的工作，肿瘤转移与细胞分离缓冲液1毫升100 × 20毫米培养皿。肿瘤是机械肉末用无菌刀片和镊子。通过5毫升血清吸管中的肿瘤细胞悬液磨碎10倍。肿瘤件应足够小，不堵塞5毫升血清吸管。
2. 肿瘤细胞悬液转移到50 mL锥形管中的细胞分解缓冲区的剩余量（填补低于50％），并在1分钟的最大速度振荡。
3. 肿瘤细胞悬液，然后在37℃2小时1分钟，每20分钟的间歇振荡。

3。消耗细胞悬浮组织碎片和死细胞

1. 2小时孵化后的细胞悬液，振荡1分钟的最高速度。
2. 细胞悬液，然后通过一个70微米的过滤器和收集在一个新的50 - mL锥形管和调整最终体积至15毫升每管。
3. 为了进一步分离可行的细胞死亡的细胞和组织碎片，肿瘤细胞悬液密度使用聚蔗糖 - 帕确加离心分离。聚蔗糖 - 帕确加衬垫pipeting加上缓慢的单元格下方小心，不要混合两​​层悬挂15毫升的聚蔗糖 - 帕确。
4. 细胞悬液和聚蔗糖层是在500X克离心30分钟，与刹车关闭。
5. 聚蔗糖 - 帕确Plus和细胞解离缓冲接口的细胞被收集并转移到一个新的50 mL锥形管。
6. 新鲜的DMEM含10％FCS的补充，加入细胞悬液稀释1:3（如20毫升新鲜媒体加入到10 ml的细胞悬液）。
7. 细胞收集在450X克离心10分钟，倒出的媒体，和细胞沉淀重悬于1毫升ALDEFLUOR缓冲区。
8. 10微升的细胞悬液稀释10μL，台盼蓝活细胞计数使用一个血球。如果在这一步中指出大量的死细胞或组织碎片，然后可重复细胞密度离心分离（步骤3.3 - 3.7）。

4。染色荧光激活细胞分选的单元格

1. 标签七个12 × 75毫米的聚苯乙烯试管作为如下：
   1. 不染
   2. CD44 - APC
   3. CD24 - PE
   4. 小鼠CD31的抗生物素蛋白+鼠标沿袭-生物素+鼠标的H - 2Kd -生物素
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG抗体_2bκ- APC + IgG抗体_2aκ聚乙烯
   7. ALDEFLUOR + CD44 - APC + CD24 - PE +鼠标CD31的抗生物素蛋白+鼠标沿袭抗生物素蛋白+鼠标的H - 2Kd -生物素。
2. ALDEFLUOR缓冲区在2毫升细胞悬液稀释到终浓度为5-10万细胞/ mL，置于冰上。添加100μL的细胞悬液，以管＃1，2，3和4，并保持他们在冰上。添加1μL，DEAB＃6管，并保持在冰上。 ALDEFLUOR试剂加入到剩余的细胞悬液，稀释1000 - 倍（如添加1.6μLALDEFLUOR试剂1.6 mL细胞悬液），拌匀，并置于冰上。 100μL这种混合物管＃5和6，其余的混合物（1.4毫升）传输管＃7。在37℃水浴40分钟中孵育管。混合细胞悬液，每10分钟一班，以防止沉淀到管底部的细胞。
3. 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬于100μLALDEFLUOR缓冲区管＃1和5的颗粒。要管＃2，3，4和6，添加100μLALDEFLUOR缓冲区包含如下稀释相应抗体，IgG _抗体 2bΚ- APC，IgG _抗体 2aΚ- PE，CD44 - APC和CD24 - PE： 1:20抗体; 1:100的小鼠CD31的抗生物素蛋白，鼠标沿袭抗生物素蛋白和鼠标的H - 2Kd生物素抗体。 7＃管加入1.4毫升的ALDEFLUOR含有CD44 - APC的1:20稀释的缓冲，CD24 - PE抗体和1:100稀释的小鼠CD31 -生物素，鼠标沿袭抗生物素蛋白，小鼠的H - 2Kd -生物素抗体。在冰上孵育10分钟的细胞悬液。
4. 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬浮颗粒在管1＃，2，3，5，6和100μLALDEFLUOR缓冲区。准备1.5毫升含1:100稀释的链霉亲和PerCP蛋白ALDEFLUOR缓冲区。加入100μL＃4管，并加入1.4毫升管＃7。在冰上孵育10分钟的细胞悬液。
5. 离心机450X克细胞和4 ° C下10分钟，然后倒出的缓冲区。重悬浮颗粒在管1＃，2，3，4，5，和6 200μLALDEFLUOR缓冲区。重悬在2.8毫升含有2μg/ mL的碘化丙啶ALDEFLUOR缓冲区＃7管沉淀。在任何时候都保持冰管。
6. 通过使用12 × 75毫米的聚苯乙烯试管过滤器，过滤器盖35微米的细胞。

5。荧光激活细胞分选分离肿瘤干细胞

1. 一个FACSAria流式细胞仪细胞分选的准备。
2. 补偿控制是从管＃1，2，3，4和5使用的细胞。
3. 盖茨创建正向和侧面散射参数的基础上，收集细胞汗衫。
4. 非滑鼠（PerCP负）和可行的（非碘化丙啶染色）细胞使用FL - 3通道的门控。
5. ALDH ⁺细胞收集的基础上，盖茨创建使用DEAB处理的细胞（＃6管）和FL - 1通道。
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺细胞是基于对盖茨收集，使用与ALDEFLUOR，IgG _抗体 2bΚ- APC和_IgG2aκ- PE（＃6管），染色细胞，使用FL - 4和FL - 2通道创建。
7. 细胞收集在12 × 75毫米聚苯乙烯测试含有1毫升辅以10％FCS的DMEM管。
8. 细胞已被排序后，离心10分钟，倒出媒体450X克细胞悬液，500μL新鲜的DMEM重悬细胞与10％FCS的补充。
9. 计数排序使用在步骤3.8中所描述的血球细胞的数量。

6。代表性的成果

该协议将导致ALDH ⁺和CD44 ⁺ CD24 ⁺胰腺癌社区体育的隔离。鼠源性细胞的比例是可变的，但我们发现，大多数人胰腺癌移植瘤包含20-60％的鼠源性细胞CD31的使用鼠标鼠标的血统鸡尾酒，和鼠标的H - 2Kd生物素标记的抗体（图1A ）。同样，每次从不同的异种移植的CSC的人口的频率是可变的，但一般我们发现，细胞总人口的1-4％是乙醛脱氢酶（图1B）和^0.2-5％的^CD44 + CD24 +（图1C）。

我们经常手动FACSAria机计数排序细胞使用血球计数，因为往往是由于不准确的FACSAria检测非细胞颗粒的。

图1。流式细胞仪的情节描绘从胰腺癌移植瘤的特定人群（一）积极在FL - 3通道的细胞染色（ ^碘化丙啶⁺鼠标CD31 ⁺鼠标沿袭+或小鼠的^H - 2Kd）被排除在外，以便隔离只可行的和非鼠源性细胞。 （二）在人胰腺癌移植瘤的乙醛脱氢酶活动ALDEFLUOR试剂ALDH1抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）的存在和缺乏流动使用流式细胞仪测定。帧代表盖茨描绘ALDH ⁺已创建的基础上与DEAB处理的细胞，然后用于未经处理的细胞的细胞。 ALDH ⁺细胞的百分比显示在门上。 （三）CD44 ⁺ CD24 ⁺门是创建的基础上与ALDEFLUOR染色的细胞，IgG _抗体 2bκ- APC（CD44 - APC的isotypic控制）和_IgG2aκ- PE（CD24 - PE isotypic控制）抗体。 CD44 ⁺ CD24 ⁺细胞的百分比显示在门上。

Discussion

本协议描述了人类异种移植胰腺社区体育隔离。在此过程中的几个关键步骤，将可行的社区体育会提高产量。的胰腺癌社区体育纯人口的复苏是依赖于FACSAria的排序前的细胞悬液中的活细胞的纯度。同时注意使用小于最大的直径1厘米的异种移植，有助于减少肿瘤中心坏死组织量。此外，消耗组织碎片和死细胞的细胞悬液，在聚蔗糖的帕确梯度离心法是至关重要的，如果大量的组织碎片或非活菌检测细胞的血球计数时可重复。

染色协议的描述，这里利用ALDEFLUOR试剂系统检测到乙醛脱氢酶的活动以及荧光标记的抗体来检测特定的细胞表面抗原。 ALDEFLUOR染色是在37 ° C和，因此，需要完成前抗体染色（冰），以防止抗体封顶的潜力，它可以发生在37 ° C由于细胞外排ALDEFLUOR试剂，重要的是保持ALDEFLUOR缓冲区的细胞在4 ° C已经完成ALDEFLUOR染色后。 ALDEFLUOR缓冲区包含了药物外排抑制剂，有助于维持细胞内的ALDEFLUOR水平。

由于这种方法分离可行的胰腺癌社区体育，他们可以应用于实验，测量这些细胞的生理功能。我们这些细胞用于肿瘤开始利用免疫功能低下小鼠的实验和体外细胞迁移/入侵检测。此外，RNA，DNA和蛋白质可以收集这些细胞的分析研究，比较CSC和非CSC人口。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235