Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

Summary

Kankerstamcellen (CSCs) zijn geïdentificeerd in een aantal maligniteiten. In dit protocol beschrijven we een flowcytometrische methode waarbij aldehyde dehydrogenase activiteit en CD44 en CD24 expressie CSCs isoleren van menselijke pancreas adenocarcinoom xenotransplantaten. Deze levensvatbare cellen kunnen vervolgens worden gebruikt in functionele en analytische studies.

Abstract

Kankerstamcellen (CSCs) zijn geïdentificeerd in een groeiend aantal van maligniteiten en functioneel bepaald door hun vermogen om zelf-vernieuwing te ondergaan en te produceren gedifferentieerde nakomelingen ^1. Deze eigenschappen laten CSCs de oorspronkelijke tumor recapituleren bij injectie in immuungecompromitteerde muizen. CSCs binnen een epitheliale maligniteit werden voor het eerst beschreven bij borstkanker en voldoet aan specifieke cel-oppervlakte-antigeen expressie (CD44 ⁺ CD24 ^{laag / -)} display ^2. Sindsdien zijn CSCs geïdentificeerd in een toenemend aantal andere menselijke maligniteiten met behulp van CD44 en CD24, evenals een aantal andere oppervlakte-antigenen. Fysiologische eigenschappen, met inbegrip aldehyde dehydrogenase (ALDH) activiteit, zijn ook gebruikt om CSCs isoleren van kwaadaardige weefsels ^3-5.

Onlangs, wij en anderen geïdentificeerd CSCs adenocarcinoom van de pancreas op basis van ALDH activiteit en de expressie van de cel oppervlakte-antigenen CD44 en CD24 en CD133 ^6-8. Deze zeer tumorigene populaties kan wel of niet overlappen en weer andere functies. We vonden dat de ALDH ⁺ en CD44 ⁺ CD24 ⁺ alvleesklier CSCs worden op dezelfde tumorigeen, maar ALDH ⁺ cellen zijn relatief meer invasieve ^8. In dit protocol beschrijven we een methode om levensvatbare alvleesklier CSCs isoleren van low-passage menselijke xenotransplantaten ^9. Xenografted tumoren worden geoogst uit muizen en gemaakt in een single-celsuspensie. Weefselstukjes en dode cellen worden gescheiden van levende cellen en vervolgens gekleurd met behulp van antilichamen tegen CD44 en CD24 en het gebruik van de ALDEFLUOR reagens, een fluorescent substraat van ALDH ^10. CSCs worden dan geïsoleerd door fluorescentie geactiveerde cel sortering. Geïsoleerde CSCs kan vervolgens worden gebruikt voor analytische of functionele tests die levensvatbare cellen.

Protocol

1. Oogst xenotransplantaten van Muizen

1. Bereid de cel dissociatie buffer: Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS), penicilline-streptomycine, 200 U / mL Collagenase type IV, en 0,6 U / mL dispase.
2. Een athymische (nu + / nu +) muis drager zijn van een subcutane humane alvleesklierkanker xenotransplantaatmodellen dat is minder dan 1 cm in grootste diameter is geëuthanaseerd door de kooldioxide stikken en cervicale dislocatie.
3. De subcutane tumor wordt geoogst uit de flank van de muis door stompe dissectie behulp van pincet en een schaar en plaatste meteen in de cel dissociatie buffer.
4. Tumoren zijn gewogen en terug geplaatst in 10 mL cel dissociatie buffer per 1 gram van de tumor weefsel.

2. Het genereren van een Single-celsuspensie van de xenotransplantaten

1. Werken in een steriele bioveiligheid kabinet, is de tumor overgebracht naar een 100 x 20 mm cultuur schotel met 1 ml cel dissociatie buffer. Tumoren zijn mechanisch gehakt met steriele scheermesjes en tang. De tumor celsuspensie wordt aangewreven door middel van een 5-mL serologische pipet 10 keer. De tumor stukken moet klein genoeg zijn om niet verstoppen de 5-mL serologische pipet.
2. De tumor celsuspensie is overgebracht naar een 50-mL conische buis met het resterende volume van de cel dissociatie buffer (gevuld minder dan 50%) en vortex op maximale snelheid gedurende 1 minuut.
3. De tumor celsuspensie wordt vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur met intermitterende vortexen gedurende 1 minuut om de 20 minuten.

3. Afbrekende celsuspensie van weefselstukjes en dode cellen

1. Na de 2-uur incubatie de celsuspensie is gevortexed op maximale snelheid gedurende 1 minuut.
2. De celsuspensie wordt vervolgens door een 70-um filter en opgevangen in een verse 50-mL conische buis en aangepast tot een uiteindelijk volume van 15 ml per buis.
3. Verder te scheiden levensvatbare cellen van dode cellen en weefsels puin, is de tumor celsuspensie van elkaar gescheiden door de dichtheid centrifugeren behulp van Ficoll-Paque Plus. Een onderlaag van Ficoll-Paque Plus wordt gemaakt door pipetteren 15 ml Ficoll-Paque Plus langzaam onder de celsuspensie zorg dat u de twee lagen te mengen.
4. De celsuspensie en Ficoll lagen is gecentrifugeerd bij 500x g gedurende 30 minuten met de remmen uitgeschakeld.
5. Cellen op het grensvlak van de Ficoll-Paque Plus en cel-dissociatie buffer worden verzameld en overgebracht naar een verse 50-mL conische buis.
6. Verse DMEM aangevuld met 10% FCS is toegevoegd aan de celsuspensie om het te verdunnen 1:3 (bv. 20 ml vers medium toegevoegd aan 10 ml celsuspensie).
7. De cellen worden verzameld door centrifugeren bij 450x g gedurende 10 minuten, gedecanteerd de media, en de cel pellet wordt geresuspendeerd in 1 ml ALDEFLUOR buffer.
8. Tien microliter van de celsuspensie wordt verdund met 10 pi trypan blauw en levensvatbare cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer. Als een groot aantal dode cellen of weefselstukjes worden geconstateerd tijdens deze stap, dan celscheiding door de dichtheid centrifugeren kan worden herhaald (stappen 3,3 tot 3,7).

4. Vlek Cellen voor Fluorescence Activated Cell Sorting

1. Label zeven 12 x 75 mm polystyreen reageerbuis als volgt:
   1. Onbevlekt
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. muis CD31-biotine + muis lijn-biotine + muis H-2Kd-biotine
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44-APC + CD24-PE + muis CD31-biotine + muis lijn-biotine + muis H-2Kd-biotine.
2. Verdun de celsuspensie in 2 ml ALDEFLUOR buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5-10 miljoen cellen / ml en blijf op ijs. Voeg 100 pi van de celsuspensie om buizen # 1, 2, 3 en 4 en houd ze op ijs. Voeg 1 ui DEAB tot buis # 6 en blijf op ijs. Voeg ALDEFLUOR reagens om de resterende celsuspensie verdund 1000 - voudige (bijv. 1,6 pi ALDEFLUOR reagens toe te voegen aan 1,6 ml celsuspensie), goed mengen, en leg ze op ijs. Breng 100 pi van dit mengsel op buizen # 5 en 6, en de resterende mengsel (1,4 ml) van de buis # 7. Incubeer alle van de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 40 minuten. Meng de celsuspensie elke 10 minuten om de cellen te voorkomen dat de afwikkeling aan de onderkant van de buizen.
3. Centrifugeer de cellen bij 450x g en 4 ° C gedurende 10 minuten en dan schenk de buffer. Resuspendeer de pellets in buizen # 1 en 5 in 100 ul ALDEFLUOR buffer. De buizen # 2, 3, 4 en 6, voeg 100 ul ALDEFLUOR buffer die de juiste antilichamen verdund als volgt uit: 01:20 voor de IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, en CD24-PEantilichamen; 1:100 voor muis CD31-biotine, muis lijn-biotine, en de muis H-2Kd-biotine antilichamen. Om tube # 7 toe te voegen 1,4 ml ALDEFLUOR buffer met een 1:20 verdunning van CD44-APC, en CD24-PE antilichamen en een 1:100 verdunning van de muis CD31-biotine, muis lijn-biotine, en de muis H-2Kd-biotine antilichamen. Incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 10 minuten.
4. Centrifugeer de cellen bij 450x g en 4 ° C gedurende 10 minuten en dan schenk de buffer. Resuspendeer de pellets in buizen # 1, 2, 3, 5 en 6 in 100 ul ALDEFLUOR buffer. Bereid 1,5 ml ALDEFLUOR buffer met een 1:100 verdunning van streptavidine-PerCP eiwit. Voeg 100 ui aan buis # 4 en voeg 1,4 mL van de buis # 7. Incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer de cellen bij 450x g en 4 ° C gedurende 10 minuten en dan schenk de buffer. Resuspendeer de pellets in buizen # 1, 2, 3, 4, 5 en 6 in 200 pi ALDEFLUOR buffer. Resuspendeer de pellet in buis # 7 in 2,8 ml ALDEFLUOR buffer met 2 ug / ml propidiumjodide. Houden buisjes op ijs te allen tijde.
6. Passeren cellen door middel van 35-um filter met behulp van 12 x 75 mm polystyreen reageerbuis met zeef caps.

5. Isoleer kanker stamcellen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering

1. Een FACSAria flowcytometer is voorbereid voor celsortering.
2. Compensatie controles zijn ingesteld met behulp van cellen van buizen # 1, 2, 3, 4 en 5.
3. Poorten zijn gemaakt op basis van forward-en zijkant-scatter parameters naar cel singlets te verzamelen.
4. Niet-muis (PerCP-negatief) en levensvatbaar is (non-propidiumiodide gekleurde cellen) zijn gated het gebruik van de FL-3-kanaal.
5. ALDH ⁺ cellen worden verzameld op basis van poorten gemaakt met behulp van DEAB-behandelde cellen (buis # 6) en de FL-1-kanaal.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ cellen worden verzameld op basis van poorten gemaakt met behulp van cellen gekleurd met ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, en IgG _2aκ-PE (buis # 6) het gebruik van de FL-4 en FL-2 kanalen.
7. Cellen worden verzameld in 12 x 75 mm polystyreen reageerbuizen met een ml DMEM aangevuld met 10% FCS.
8. Na de cellen zijn gesorteerd, centrifuge de celsuspensie op 450x g gedurende 10 minuten, giet de media, en resuspendeer de cellen in 500 ui verse DMEM aangevuld met 10% FCS.
9. Tel het aantal gesorteerde cellen met behulp van een hemocytometer zoals beschreven in stap 3.8.

6. Representatieve resultaten

Dit protocol zal leiden tot de isolatie van ALDH ⁺ en CD44 ⁺ CD24 ⁺ alvleesklier CSCs. Het percentage van de muis-afgeleide cellen is variabel, maar we hebben gemerkt dat de meeste menselijke alvleesklierkanker xenotransplantaten 20-60% bevatten muis-afgeleide cellen met de muis CD31, muis afkomst cocktail, en de muis H-2Kd biotine-geconjugeerde antilichamen (Figuur 1A ). Ook de frequentie van elk CSC populatie van verschillende xenotransplantaten is variabel, maar over het algemeen hebben we ontdekt dat 1-4% van de totale celpopulatie is ALDH ⁺ (Figuur 1B) en 0,2-5% is CD44 ⁺ CD24 ⁺ (figuur 1C).

We regelmatig handmatig tellen gesorteerd cellen met behulp van een hemocytometer sinds de FACSAria machine telt zijn vaak onnauwkeurig te wijten aan niet-cellulaire deeltjes gedetecteerd door de FACSAria.

Figuur 1. Flowcytometrie plot beeltenis van specifieke populaties van een alvleesklierkanker xenograft. (A) Cellen kleuring positief in de FL-3 kanaal (propidiumjodide ^+, CD31 ⁺ muis muis ⁺ afkomst, of muis H-2Kd ⁺⁾ zijn zo uitgesloten om alleen te isoleren levensvatbare en niet-muis afgeleide cellen. (B) ALDH activiteit in een menselijke pancreas kanker xenotransplantaatmodellen werd gemeten door flowcytometrie met behulp van de ALDEFLUOR reagens in de aanwezigheid en afwezigheid van de ALDH1 inhibitor diethylamino-benzaldehyde (DEAB). De frames vertegenwoordigen poorten die ALDH ⁺ cellen die zijn gemaakt op basis van cellen behandeld met DEAB en vervolgens toegepast op onbehandelde cellen weer te geven. De percentages van ALDH ⁺ cellen worden getoond in de poort. (C) De CD44 ⁺ CD24 ⁺ poort werd gemaakt op basis van cellen gekleurd met ALDEFLUOR, en de IgG _2bκ-APC (isotypic controle voor CD44-APC) en IgG _2aκ-PE (isotypic controle voor CD24-PE) antilichamen. De percentages van CD44 ⁺ CD24 ⁺ cellen worden getoond in de poort.

Discussion

Dit protocol beschrijft de isolatie van pancreatische CSCs uit menselijke xenotransplantaten. Een aantal belangrijke stappen in deze procedure zal de opbrengst van levensvatbare CSCs. Het herstel van een zuivere populatie van de alvleesklier CSCs is afhankelijk van de zuiverheid van levensvatbare cellen aanwezig in de celsuspensie vóór sortering op de FACSAria. Zorg ervoor dat xenotransplantaten die minder dan 1 cm in grootste diameter te gebruiken helpt om de hoeveelheid necrotisch weefsel te verminderen in het midden van de tumor. Daarnaast putten de celsuspensie van weefsel puin en dode cellen tijdens Ficoll-Paque gradiënt centrifugatie is kritisch en kan herhaald worden als een groot aantal van weefselstukjes of niet-levensvatbare cellen worden gedetecteerd wanneer de cellen worden geteld op de hemocytometer.

De kleuringsprotocol hier beschreven maakt gebruik van de ALDEFLUOR reagens systeem ALDH activiteit evenals fluorofoor-geconjugeerde opsporing van antilichamen tegen specifieke cel oppervlakte-antigenen op te sporen. ALDEFLUOR kleuring is uitgevoerd bij 37 ° C, en daarom moet worden ingevuld voordat antilichaam kleuring (op ijs) de mogelijkheden voor antilichamen aftopping, wat kan gebeuren bij 37 ° C te voorkomen Omdat cellen kunnen efflux de ALDEFLUOR reagens, is het belangrijk om de cellen in ALDEFLUOR buffer te handhaven op 4 ° C na ALDEFLUOR vlekken is voltooid. De ALDEFLUOR buffer bevat een drug efflux remmer die helpt om intracellulaire niveaus van ALDEFLUOR.

Omdat deze methode isoleert levensvatbaar alvleesklier CSCs ze kunnen worden toegepast in een aantal experimenten die de fysiologische functie van deze cellen te meten. We hebben deze cellen voor tumor-initiatie assays gebruik te maken van immuungecompromitteerde muizen en in vitro celmigratie / invasie assays. Bovendien kan RNA, DNA en eiwitten worden verzameld uit deze cellen voor analytische studies vergelijken CSC en niet-CSC populaties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235