Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenografts

Summary

Krebsstammzellen (CSCS) haben in einer Reihe von Tumoren identifiziert worden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine durchflusszytometrische Methode unter Verwendung Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität und CD44 und CD24-Expression auf CSCs aus menschlichen Pankreaskarzinom Xenotransplantate isolieren. Diese entwicklungsfähigen Zellen können dann in funktionelle und analytische Untersuchungen verwendet werden.

Abstract

Krebsstammzellen (CSCS) haben in einer wachsenden Zahl von bösartigen Erkrankungen festgestellt worden und werden funktionell durch ihre Fähigkeit zur Selbst-Erneuerung unterzogen und produzieren differenzierte Nachkommenschaft ¹ definiert. Diese Eigenschaften ermöglichen CSCs dem ursprünglichen Tumor rekapitulieren, wenn sie in immungeschwächten Mäusen injiziert. CSCs innerhalb eines epithelialen Malignomen wurden zunächst bei Brustkrebs beschrieben und festgestellt, dass spezifische Zelloberflächen-Antigen-Expression (CD44 ⁺ CD24 ^{low / -)} Display ^2. Seitdem haben CSCs in einer wachsenden Zahl von anderen menschlichen Tumoren mit CD44 und CD24 sowie eine Reihe weiterer Oberflächenantigene identifiziert worden. Physiologische Eigenschaften, einschließlich Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) Aktivität, wurden ebenfalls verwendet, um CSCs von malignen Geweben ^3-5 isolieren.

Kürzlich haben wir festgestellt, und andere CSCs von Pankreaskarzinomen auf ALDH Aktivität und der Ausdruck der Zelloberflächen-Antigene CD44 und CD24 und CD133 ^6-8. Diese hoch tumorigenen Populationen kann oder auch nicht überlappen und Anzeige weiterer Funktionen. Wir fanden, dass ALDH ⁺ und CD44 ⁺ CD24 ⁺ Pankreas CSCs sind ähnlich tumorigenen, aber ALDH ⁺ Zellen sind relativ invasive ^8. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um lebensfähige Pankreas CSCs von Low-Passage menschlichen Xenotransplantate ⁹ zu isolieren. Xenotransplantiert Tumoren von Mäusen geerntet und zu einem Einzel-Zell-Suspension. Gewebereste und tote Zellen von lebenden Zellen getrennt und dann gefärbt mit Antikörpern gegen CD44 und CD24 und mit dem ALDEFLUOR Reagenz, ein fluoreszierendes Substrat der ALDH ^10. CSCs werden dann mittels Fluoreszenz-activated cell sorting isoliert. Isolierte CSCs kann dann für analytische oder funktionellen Assays erfordern lebensfähigen Zellen verwendet werden.

Protocol

1. Ernte Xenografts von Mice

1. Bereiten Sie die Zelle Dissoziationspuffer: Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin-Streptomycin, 200 U / ml Collagenase Typ IV, und 0,6 U / ml Dispase ergänzt.
2. Ein athymischen (nu + / nu +) Maus beherbergt eine subkutane humanen Pankreaskarzinom Xenotransplantat, dass weniger als 1 cm in größter Durchmesser ist durch Kohlendioxid Ersticken und Genickbruch getötet.
3. Die subkutane Tumor ist von der Flanke der Maus durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette und Schere geerntet und legte sofort in die Zelle Dissoziationspuffer.
4. Tumore werden gewogen und wieder in 10 mL Zelle Dissoziationspuffer pro 1 Gramm Tumorgewebe platziert.

2. Generieren Sie eine Einzel-Zell-Suspension aus dem Xenografts

1. Arbeiten in einem sterilen Biosicherheitswerkbank ist der Tumor auf eine 100 x 20 mm Kulturschale mit 1 ml der Zell-Dissoziation Puffer übertragen. Tumoren sind mechanisch zerkleinert mit sterilen Rasierklingen und Pinzetten. Die Tumorzelle Suspension wird durch ein 5-ml-serologischen Pipette 10 mal verrieben. Der Tumor Stücke sollten klein genug, um nicht verstopfen die 5-mL serologischen Pipette.
2. Die Tumorzelle Suspension wird auf einem 50-mL konischen Rohr mit dem restlichen Volumen der Zelle Dissoziationspuffer (gefüllt weniger als 50%) überführt und verwirbelt bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute.
3. Der Tumor Zellsuspension wird dann bei 37 ° C für 2 Stunden mit intermittierenden Vortexen für 1 Minute alle 20 Minuten inkubiert.

3. Führen Zellsuspension von Gewebereste und toten Zellen

1. Nach der 2-stündigen Inkubation der Zellsuspension wird bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute gevortext.
2. Die Zellsuspension wird dann durch ein 70-um-Filter geleitet und in einem frischen 50-mL konischen Rohr und angepasst, um ein Endvolumen von 15 ml pro Röhrchen.
3. Zur weiteren separaten lebensfähigen Zellen von toten Zellen und Gewebereste, wird der Tumor Zellsuspension durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque Plus-getrennt. Eine Unterlage von Ficoll-Paque Plus ist durch Pipettieren 15 ml Ficoll-Paque Plus-langsam unter der Zellsuspension man aufpassen, nicht zu den beiden Schichten vermischen erstellt.
4. Die Zellsuspension und Ficoll Schichten sind bei 500x g für 30 Minuten mit den Bremsen zentrifugiert ausgeschaltet.
5. Cells an der Schnittstelle von der Ficoll-Paque Plus und Zelle Dissoziationspuffer werden gesammelt und in ein frisches 50-mL konischen Rohr.
6. Frische DMEM mit 10% FCS zu der Zellsuspension gegeben, um es zu verdünnen 1:3 (zB 20 ml frisches Medium zugesetzt, um 10 ml Zellsuspension).
7. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 450x g für 10 Minuten, die Medien dekantiert gesammelt, und das Zellpellet in 1 ml ALDEFLUOR resuspendiert.
8. Zehn Mikroliter der Zellsuspension mit 10 l Trypanblau und lebensfähigen Zellen gezählt werden unter Verwendung eines Hämocytometers verdünnt. Wenn eine große Anzahl von toten Zellen oder Gewebe Fremdkörper in diesem Schritt werden zur Kenntnis genommen, dann Zellseparation durch Dichtezentrifugation kann wiederholt werden (Schritte von 3,3 bis 3,7) werden.

4. Stain Cells für Fluorescence Activated Cell Sorting

1. Label sieben 12 x 75 mm Polystyrol Reagenzgläser wie folgt:
   1. Unbefleckt
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. Maus CD31-Biotin + Mauslinie-Biotin + Maus H-2KD-Biotin
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44-APC + CD24-PE + Maus CD31-Biotin + Mauslinie-Biotin + Maus H-2KD-Biotin.
2. Verdünnen der Zellsuspension in 2 ml ALDEFLUOR Puffer auf eine Endkonzentration von 5-10 Millionen Zellen / ml und halten auf dem Eis. 100 l der Zellsuspension in Röhrchen Nr. 1, 2, 3 und 4 und halten sie auf dem Eis. Add 1 ul DEAB zu Rohr Nr. 6 und halten auf dem Eis. Add ALDEFLUOR Reagenz, um die verbleibenden Zellsuspension verdünnt 1000 - fach (zB add 1,6 ul ALDEFLUOR Reagenz zu 1,6 ml Zellsuspension), gut mischen und auf Eis stellen. Transfer 100 ul dieser Mischung Rohre Nr. 5 und 6, und das verbleibende Gemisch (1,4 ml) mit dem Rohr Nr. 7. Inkubieren alle Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 40 Minuten. Mischen Sie die Zellsuspension alle 10 Minuten, um die Zellen absetzen, um den Boden der Rohre zu verhindern.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450x g und 4 ° C für 10 Minuten und dann dekantieren den Puffer. Resuspendieren der Pellets in Rohren Nr. 1 und 5 in 100 ul ALDEFLUOR Puffer. Um Rohre Nr. 2, 3, 4 und 6, 100 l von ALDEFLUOR Puffer mit den entsprechenden Antikörpern wie folgt verdünnt: 1:20 für IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC und CD24-PEAntikörper, 1:100 für Maus CD31-Biotin-, Maus-Linie-Biotin und Maus H-2KD-Biotin-Antikörpern. Um Rohr Nr. 7 hinzufügen, 1,4 ml ALDEFLUOR Puffer mit einer 1:20 Verdünnung des CD44-APC und CD24-PE-Antikörper und eine 1:100 Verdünnung des Maus CD31-Biotin-, Maus-Linie-Biotin und Maus H-2KD-Biotin Antikörper. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen auf Eis für 10 Minuten.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450x g und 4 ° C für 10 Minuten und dann dekantieren den Puffer. Resuspendieren der Pellets in Rohren Nr. 1, 2, 3, 5 und 6 in 100 ul ALDEFLUOR Puffer. Bereiten Sie 1,5 ml ALDEFLUOR Puffer mit einer 1:100 Verdünnung von Streptavidin-PerCP Protein. 100 l bis Rohr Nr. 4 und fügen 1,4 ml bis Rohr Nr. 7. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen auf Eis für 10 Minuten.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450x g und 4 ° C für 10 Minuten und dann dekantieren den Puffer. Resuspendieren der Pellets in Rohren Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 in 200 ul ALDEFLUOR Puffer. Das Pellet in Rohr Nr. 7 in 2,8 ml ALDEFLUOR Puffer mit 2 pg / mL Propidiumiodid. Keep Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten.
6. Pass-Zellen durch 35-um-Filter mit 12 x 75 mm Polystyrol Reagenzgläser mit Sieb caps.

5. Isolieren Cancer Stem Cells durch Fluorescence Activated Cell Sorting

1. Ein FACSAria Durchflusszytometer ist für Zellsortierung vorbereitet.
2. Compensation Kontrollen werden mit Hilfe von Zellen aus Rohren Nr. 1, 2, 3, 4 und 5.
3. Tore werden auf der Basis nach vorne und seitlich Streuparameter geschaffen, um Zelle Singuletts zu sammeln.
4. Non-Maus (PerCP-negativ) und lebensfähigen (non-Propidiumiodid gefärbten Zellen) sind gated mit dem FL-3-Kanal.
5. ALDH ^+-Zellen werden auf der Grundlage Tore gesammelt erstellt mit DEAB-behandelten Zellen (Tube # 6) und die FL-1 Kanal.
6. CD44 ⁺ CD24 ^+-Zellen werden auf der Grundlage Tore gesammelt erstellt unter Verwendung von Zellen mit ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC und IgG _2aκ-PE (Tube # 6) gefärbt mit dem FL-4 und FL-2-Kanäle.
7. Die Zellen werden in 12 x 75 mm Polystyrol-Röhrchen mit 1 ml DMEM mit 10% FCS gesammelt.
8. Nach Zellen sortiert wurden, Zentrifuge die Zellsuspension bei 450x g für 10 Minuten, giesst die Medien und die Zellen in 500 ul frisches DMEM, ergänzt mit 10% FCS.
9. Zählt die Anzahl der sortierten Zellen mit einer Zählkammer, wie in Schritt 3.8 beschrieben.

6. Repräsentative Ergebnisse

Dieses Protokoll wird auf die Isolierung von ALDH ⁺ und CD44 ⁺ CD24 ⁺ Pankreas CSCs führen. Der Anteil der Maus-abgeleiteten Zellen ist variabel, aber wir haben festgestellt, dass die meisten menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenotransplantate 20-60% enthalten Maus-abgeleiteten Zellen mit der Maus CD31, Mauslinie Cocktail und Maus H-2KD Biotin-konjugierte Antikörper (Abbildung 1A ). Auch die Häufigkeit der einzelnen CSC Bevölkerung aus verschiedenen Xenotransplantate ist variabel, aber generell haben wir festgestellt, dass 1-4% der gesamten Zellpopulation ALDH ⁺ (Abbildung 1B) und 0,2-5% ist CD44 ⁺ CD24 ⁺ (Abbildung 1C).

Wir routinemäßig manuell zählen sortierten Zellen mit einer Zählkammer seit FACSAria Maschine zählt oft ungenau durch nicht-zelluläre Partikel durch die FACSAria erkannt.

Abbildung 1. Durchflusszytometrie Handlung darstellt bestimmte Bevölkerungsgruppen aus einem Pankreaskarzinom Xenotransplantat. (A) Zellen Färbung positiv in die FL-3-Kanal (Propidiumiodid ^+, Maus CD31 ⁺ Mauslinie ⁺ oder Maus H-2KD ⁺⁾ sind ausgeschlossen, so dass nur isolieren lebensfähigen und nicht-Maus-abgeleiteten Zellen. (B) ALDH Aktivität in einer humanen Pankreaskarzinom Xenograft wurde mittels Durchflusszytometrie mit dem ALDEFLUOR Reagens in Gegenwart und Abwesenheit der ALDH1 Inhibitor diethylamino-benzaldehyd (DEAB) gemessen. Die Frames darstellen Tore, ALDH ⁺ Zellen, basierend auf Zellen mit DEAB behandelt erstellt wurden und dann auf unbehandelten Zellen darzustellen. Der Anteil der ALDH ⁺ Zellen im Tor gezeigt. (C) Die CD44 ⁺ CD24 ⁺ Tor wurde basierend auf Zellen mit ALDEFLUOR gebeizt erstellt, und die IgG _2bκ-APC (Isotypiekontrolle für CD44-APC) und IgG _2aκ-PE (Isotypiekontrolle für CD24-PE)-Antikörpern. Der prozentuale Anteil der CD44 ⁺ CD24 ^+-Zellen sind in das Tor gezeigt.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Pankreas-CSCs aus menschlichem Xenotransplantate. Mehrere wichtige Schritte in diesem Verfahren wird die Ausbeute von lebensfähigen CSCs. Die Wiederherstellung einer reinen Population von Pankreas-CSCs ist abhängig von der Reinheit der lebensfähigen Zellen in der Zellsuspension vor dem Sortieren auf dem FACSAria. Darauf zu achten Xenotransplantate, dass weniger als 1-cm in größter Durchmesser verwenden hilft, die Menge von nekrotischem Gewebe in der Mitte des Tumors zu reduzieren. Zusätzlich zum Abbau der Zellsuspension von Gewebereste und toten Zellen während der Ficoll-Paque Gradientenzentrifugation ist kritisch und kann wiederholt werden, wenn eine große Anzahl von Gewebereste oder nicht lebensfähigen Zellen erkannt werden, wenn die Zellen auf die Zählkammer gezählt werden.

Die Färbung hier beschriebene Protokoll nutzt die ALDEFLUOR Reagenz System ALDH Aktivität sowie Fluorophor-konjugierten Antikörpern an spezifische Oberflächenantigene erkennen. ALDEFLUOR Färbung ist bei 37 ° C und daher muss abgeschlossen sein, bevor Antikörper-Färbung (auf Eis) das Potential für die Antikörper-Deckelung, die bei 37 ° C auftreten können verhindern, dass sein Da Zellen des ALDEFLUOR Reagenz Efflux kann, ist es wichtig, die Zellen in ALDEFLUOR Puffer bei 4 ° C zu halten, nachdem ALDEFLUOR Färbung ist abgeschlossen. Die ALDEFLUOR Puffer enthält eine Efflux-Inhibitor, der Aufrechterhaltung intrazellulären ALDEFLUOR hilft.

Da diese Methode isoliert lebensfähig Pankreas CSCs können sie in einer Reihe von Experimenten, die die physiologische Funktion dieser Zellen beantragt werden. Wir haben diese Zellen für die Tumor-Initiation Assays immungeschwächten Mäusen und in vitro Zell-Migration / Invasion Assays verwendet. Darüber hinaus kann RNA, DNA und Protein aus diesen Zellen für analytische Studien zum Vergleich von CSC und Nicht-CSC Bevölkerung gesammelt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235