ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Summary

がん幹細胞（CSC）が悪性腫瘍の数が同定されている。このプロトコルでは、ヒト膵臓腺癌の異種移植片からCSCを分離するアルデヒド脱水素酵素活性とCD44とCD24の発現を利用したフローサイトメトリー法を説明します。これらの生細胞は、機能的分析の研究で使用することができます。

Abstract

がん幹細胞（CSC）が悪性腫瘍の増加に同定されており、機能的に自己再生を受け、分化した子孫^1を生成する能力によって定義されます。これらのプロパティは、免疫不全マウスに注入するとCSCは、元の腫瘍を再現することができます。上皮悪性腫瘍内のCSCは、最初の乳癌で記述し、特定の細胞表面抗原の発現（CD44 ⁺ CD24 ^{低/ - ）}を表示することが見出された^2。それ以来、CSCは、CD44とCD24を使用して、他のヒト悪性腫瘍の増加だけでなく、他の表面抗原の数で確認されている。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）活性、生理的な特性は、、また悪性組織^3月5日からCSCを分離するために使用されています。

最近、我々と他の人はALDH活性と細胞表面抗原CD44とCD24、およびCD133 ^6-8の発現に基づいて、膵臓腺癌からCSCを同定した。これらの高度に腫瘍発生の集団はまたは重複になると他の機能が表示されない場合があります。我々が発見したALDH ⁺とCD44 ⁺ CD24 ⁺膵臓のCSCは、同様に腫瘍形成であるが、ALDH ⁺細胞は、比較的多くの侵襲的な⁸である。このプロトコルでは、継代数の低い人間の異種移植片⁹から実行可能な膵臓CSCを分離する方法を説明します。異種移植腫瘍は、マウスから採取し、単一細胞懸濁液に作られています。組織の残骸や死細胞は生細胞から分離し、CD44とCD24に対する抗体を使用し、ALDEFLUOR試薬、ALDH ¹⁰の蛍光基質を用いて染色される。 CSCは、蛍光活性化細胞選別によって分離されています。隔離されたCSCはその後、生細胞を必要とする分析的または機能的アッセイに使用することができます。

Protocol

1。マウスから収穫の異種移植

1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン - ストレプトマイシン、200 U / mLのコラゲナーゼIV型、および0.6 U / mLのディスパーゼを添加した：細胞解離バッファーを準備します。
2. 最大直径1cm未満である皮下ヒト膵臓癌異種移植を保有する無胸腺（NU + / NU +）マウスは、二酸化炭素の窒息と頸椎脱臼により安楽死させています。
3. 皮下腫瘍は​​、鉗子とハサミを用いて鈍的切開によってマウスの脇腹から採取し、細胞解離緩衝液中で直後に配置されます。
4. 腫瘍の重量を測定し、腫瘍組織の1グラムあたり10 mLの細胞解離バッファーに戻されている。

2。異種移植片からの単一細胞懸濁液を生成する

1. 無菌バイオセーフティーキャビネットでの作業、腫瘍は細胞解離緩衝液1 mLと100 × 20 ​​mmの培養皿に転送されます。腫瘍は、機械的に無菌のかみそりの刃やピンセットを使って刻まれている。腫瘍細胞懸濁液を5 mLの血清学的ピペットを通して10回トリチュレートしています。腫瘍の部分は、5 mLの血清学的ピペットを詰まらせないために十分小さくする必要があります。
2. 腫瘍細胞懸濁液は、細胞解離バッファー（塗りつぶされた50％未満）の残りのボリュームを含む50 mLコニカルチューブに移し、1分間最大速度でボルテックスしています。
3. 腫瘍細胞懸濁液は、℃で2時間1分毎に20分間断続的にボルテックスしながら37℃でインキュベートされる。

3。組織破片及び死細胞の細胞懸濁液を使い果たす

1. 2時間のインキュベーション後に細胞懸濁液は、1分間の最大速度でボルテックスしています。
2. 細胞懸濁液を70μmのフィルターを通し、新鮮な50 mLコニカルチューブに回収し、チューブ当たり15 mlの最終量に調整されます。
3. 死んだ細胞や組織の残骸からさらに別の生細胞に、腫瘍細胞懸濁液をFicoll - Paque Plusを使用して密度遠心分離によって分離される。をFicoll - Paqueプラスの下敷きは、プラス徐々に二つの層を混在しないように注意して細胞懸濁液の下をFicoll - Paque 15mLをペッティングすることによって作成されます。
4. ブレーキをオフにして細胞懸濁液とフィコール層は30分間500分の1 gで遠心分離されています。
5. をFicoll - Paqueプラスと細胞解離バッファーの界面で細胞を回収し、新鮮な50 mLコニカルチューブに移しています。
6. 新鮮なDMEMに10％FCSを添加することは、それを希釈するために細胞懸濁液に添加される1:3（例：20mLの新鮮な培地は、細胞懸濁液を10mLに追加された）。
7. 細胞を10分間、450 gで遠心分離によって収集され、メディアはデカントし、細胞ペレットは、ALDEFLUOR緩衝液1 mLに再懸濁する。
8. 細胞懸濁液10μlを10μLトリパンブルーと生細胞血球計数器を使用してカウントしているで希釈する。死んだ細胞や組織の破片が多数このステップ中に明記されている場合は、密度遠心分離による細胞の分離は、（ - 3.7ステップ3.3）を繰り返すことができます。

4。蛍光活性化細胞選別のための細胞を染色

1. としてラベルseven 12 × 75 mmのポリスチレン試験管は次のとおりです。
   1. 汚点のない
   2. CD44 - APC
   3. CD24 - PE
   4. マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH - 2KD -ビオチン
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG抗体_2bκ- APC + IgG抗体_2aκ- PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 - APC + CD24 - PE +マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH - 2KD -ビオチン。
2. 百万円50〜10細胞/ mLの最終濃度にALDEFLUORの緩衝液2 mLの細胞懸濁液を希釈し、氷上に置きます。チューブ＃1、2、3、および4に細胞懸濁液100μLを加え、氷上で保管して下さい。チューブ＃1〜6μLDEABを追加し、氷上に置きます。 1000希釈、残りの細胞懸濁液にALDEFLUOR試薬を追加 - 倍（例えば1.6 mLの細胞懸濁液1.6μLALDEFLUOR試薬を加える）、よく混ぜて、そして氷上に置きます。チューブ＃7に100チューブ＃5と6にこの混合物のμL、および残りの混合液（1.4 mL）を転送する。 40分37℃の水浴中でチューブのすべてをインキュベートする。チューブの底に沈降する細胞を防止するために細胞懸濁液は10分ごとに混ぜる。
3. 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。 100μLALDEFLUORバッファー中で1位と5管でペレットを再懸濁します。チューブ＃2、3、4、および6に、次のように希釈し、適切な抗体を含むALDEFLUOR緩衝液100μLを追加します。IgG抗体_2bΚ- APC、IgG抗体_2aΚ- PE、CD44 - APC、およびCD24 - PEの1時20分抗体、マウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH - 2KD -ビオチン抗体の1:100。チューブ＃7を追加CD44 - APCの1:20希釈を含むALDEFLUORバッファー1.4 mLを加え、CD24 - PE抗体とマウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH - 2KD -ビオチンの1:100希釈へ抗体。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。
4. 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、5、および100μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。ストレプトアビジン- PerCP蛋白質の100倍希釈液を含むALDEFLUORバッファーを1.5 mlを準備します。チューブに100μLを追加して＃4とチューブ＃7に1.4 mLを加える。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。
5. 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、4、5、および200μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。濃度2μg/ mLのヨウ化プロピジウムを含むALDEFLUORバッファー2.8 mLのチューブ＃7でペレットを再懸濁する。すべての回でチューブを氷中に保管してください。
6. ストレーナーのキャップで12 × 75 mmのポリスチレン試験管を用いて35μmのフィルターを介して細胞を渡します。

5。蛍光活性化細胞選別により、がん幹細胞を分離

1. FACSAriaフローサイトメーターは、細胞選別のために準備されます。
2. 補償のコントロールは、チューブ＃1、2、3、4、および5からセルを使用して設定されます。
3. ゲイツは、細胞のシングレットを収集するために前方および側散乱パラメータに基づいて作成されます。
4. 非マウス（PerCP陰性）と実行可能な（非ヨウ化プロピジウムで染色）細胞は、FL - 3チャンネルを使用してゲートです。
5. DEAB処理した細胞（チューブ＃6）とFL - 1チャンネルを使用して作成されたALDH ⁺細胞は、ゲートに基づいて収集されます。
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺細胞は、ゲートに基づいて収集されているFL - 4とFL - 2チャネルを使用してALDEFLUOR、IgG抗体_2bΚ- APC、および_IgG2aκ- PE（チューブ＃6）で染色した細胞を使用して作成した。
7. 細胞を10％FCSを補充したDMEM 1mLを含む12 × 75 mmのポリスチレン試験管に集められています。
8. 細胞がソートされた後、デカント10分、メディアのために450 gで細胞懸濁液を遠心し、500μLの新しいDMEMに懸濁し、10％FCSを補充した。
9. としてステップ3.8節血球計数器を用いて選別された細胞の数を数えます。

6。代表的な結果

このプロトコルは、ALDH ⁺とCD44 ⁺ CD24 ⁺膵臓のCSCの分離につながる。マウス由来の細胞の割合は可変ですが、我々は、ほとんどのヒト膵臓癌の異種移植片は、マウスCD31を用いて、マウス由来の細胞、マウスの系統のカクテル、そしてマウスH - 2KDビオチン標識抗体（図1A 20〜60％が含まれていることを見出した）。同様に異なる異種移植片から各CSCの人口の周波数は可変であるが、一般的に我々は、総細胞集団の1-4％がALDH ^+（図1B）であり、0.2から5パーセントは、CD44 ⁺ CD24 ^+（図1C）であることを見出した。

FACSAriaのマシンの数がしばしば原因FACSAriaによって検出される非細胞性粒子に不正確なので、我々は日常的に手動で血球計数器を使用してソートされた細胞を数える。

図1。膵臓癌の異種移植片からの特定の集団を描いた、フローサイトメトリープロット。（）FL - 3チャネル（ヨウ化プロピジウム^+、マウスCD31 ⁺マウスの系統^+、またはマウスH - 2KD ^+）に積極的に染色細胞は分離するように除外されています実行可​​能と非マウス由来の細胞。 （B）ヒト膵臓癌異種移植におけるALDH活性はALDH1の阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド（DEAB）の存在下および非存在下でALDEFLUOR試薬を用いたフローサイトメトリーにより測定した。フレームは、DEAB処理した細胞に基づいて作成し、未処理の細胞に適用されたALDH ⁺細胞を描くゲートを表しています。 ALDH ⁺細胞の割合がゲートに示されています。 （C）CD44 ⁺ CD24 ⁺ゲートは、ALDEFLUORで染色した細胞、および_IgG2bκ- APC（CD44 - APC用アイソタイプコントロール）および_IgG2aκ- PE（CD24 - PEのアイソタイプコントロール）抗体に基づいて作成されました。 CD44 ⁺ CD24 ⁺細胞の割合は、ゲートに示されています。

Discussion

このプロトコルは、ヒトの異種移植片からの膵臓のCSCの分離を説明します。この手順では、いくつかの重要な手順は、実行可能なCSCがの収量を向上させます。膵臓のCSCの純粋な人口の回復はFACSAriaでの並べ替えの前に細胞懸濁液中に存在する生細胞の純度に依存しています。最大直径1センチ未満の異種移植片を使用するように注意しながら腫瘍の中心部に壊死組織の量を減らすのに役立ちます。さらに、をFicoll - Paque勾配遠心分離時の組織の残骸や死細胞の細胞懸濁液を破壊することは非常に重要ですし、細胞を血球計でカウントされているときに組織の破片や非生存細胞の数が多いが検出された場合に繰り返すことができます。

ここで説明する染色のプロトコルは、特定の細胞表面抗原を検出するためのALDH活性だけでなく、蛍光色素標識抗体を検出するためにALDEFLUOR試薬のシステムを利用しています。 ALDEFLUOR染色は37℃と、それゆえ、37℃で起こることができる、キャッピング抗体の可能性を防ぐために（氷上）抗体染色の前に完了する必要がある℃を実行される細胞がALDEFLUOR試薬を排出できるので、それがALDEFLUORの染色が完了した後4℃でALDEFLUORバッファーで細胞を維持することが重要です。 ALDEFLUORバッファーはALDEFLUORの細胞内レベルを維持できるように薬剤排出抑制剤が含まれています。

このメソッドは実行可能な膵臓CSCを分離するので、それらはこれらの細胞の生理的機能を測定する実験の数に適用することができます。我々は、免疫不全マウスおよびin vitroでの細胞移動/浸潤アッセイを利用した腫瘍イニシエーションアッセイのためにこれらの細胞を使用している。さらに、RNA、DNA、及びタンパク質は、CSCと非CSC集団を比較分析研究のためにこれらの細胞から採取することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235