Summary
암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 증가에 확인된하고 기능 자기 갱신을 받아야하고 차별화된 자손 하나를 생산하는 능력에 의해 정의됩니다. 이러한 속성은 immunocompromised 생쥐에 주입했을 때 CSCs 원래 종양 요점을 되풀이 수 있습니다. 상피 강한 악의 이내 CSCs 먼저 유방암에 설명된 및 특정 세포 표면 항원 발현 (CD44 + CD24 낮은 / -) 표시 발견된 2. 이후 CSCs는 CD44과 CD24뿐만 아니라 다른 표면 항원의 번호를 사용하여 다른 사람 malignancies의 증가에서 확인되었습니다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH) 활동을 포함한 Physiologic 속성, 또한 3-5 악성 조직에서 CSCs을 분리하는 데 사용되었습니다.
최근 우리와 다른 ALDH 활동과 세포 표면 항원 CD44와 CD24, CD133과 6-8의 표현에 따라 췌장 선암에서 CSCs을 확인. 이러한 고도로 tumorigenic 인구하거나 수 중복 및 기타 기능이 표시되지 않을 수 있습니다. 우리는 발견 ALDH + 및 CD44 + CD24 + 췌장 CSCs가 비슷하게 tumorigenic하지만, ALDH + 세포가 상대적으로 더 많은 침략 8. 이 프로토콜에서는 낮은 통로 인간 xenografts 9 시부터 가능한 췌장 CSCs을 분리하는 방법을 설명합니다. Xenografted 종양은 생쥐에서 수확 및 단일 세포 현탁액으로 만들어집니다. 조직 파편과 죽은 세포는 살아 세포에서 분리 후 CD44과 CD24에 대한 항체를 사용하고 ALDEFLUOR 시약, ALDH 10 형광 기판을 사용하여 얼룩 있습니다. CSCs 그때 형광 활성 세포 분류에 의해 격리됩니다. 절연 CSCs 그런 다음 가능한 세포를 필요로하는 분석이나 기능 assays 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 마우스에서 수확 Xenografts
- Dulbecco의 수정된 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 페니실린 - 스트렙토 마이신, 200 U / ML Collagenase 종류 IV, 그리고 0.6 U / ML dispase와 함께 보충 : 세포 분리 버퍼를 준비합니다.
- 가장 큰 지름 1cm 미만입니다 피하 인간의 췌장암의 이종 이식을 품고 athymic (뉴 + / 뉴 +) 마우스는 이산화탄소 질식 및 경추 전위에 의해 euthanized있다.
- 피하 종양은 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 마우스의 측면에서 수확하고 세포 분리 버퍼에 즉시 배치됩니다.
- 종양은 무게와 종양 조직 1g 당 10 ML 세포 분리 버퍼에 다시 배치됩니다.
2. Xenografts에서 단일 셀 서스펜션을 생성
- 멸균 biosafety 캐비닛에 근무, 종양 세포 분리 버퍼 1 ML과 100 X 20mm 문화 요리로 전송됩니다. 종양은 기계 살균 면도날과 집게를 사용하여 다진 있습니다. 종양 세포 현탁액은 5 ML serological pipet을 통해 10 번 triturated입니다. 종양 조각은 5 ML serological pipet을 방해할하지 않을 정도로해야합니다.
- 종양 세포 현탁액이 세포 분리 버퍼의 나머지 볼륨 (50 % 미만 가득)가 포함된 50 ML 원뿔 관에 전송하고 1 분 최대 속도 vortexed입니다.
- 종양 세포 현탁액은 다음 ° C 2 시간 일분 매 20 분 동안 간헐적으로 vortexing와 함께 37 incubated입니다.
3. 세포 조직 파편의 서스펜션과 죽은 세포를 고갈
- 2 시간 배양 후 세포 현탁액은 1 분 최대 속도 vortexed입니다.
- 세포 현탁액은 다음 70 μm의 필터를 통과하고 신선한 50 ML 원뿔 튜브의 수집 관 당 15 ML의 최종 볼륨으로 조정됩니다.
- 죽은 세포 및 조직의 잔해로부터 더욱 분리 가능한 세포, 종양 세포 현탁액은 Ficoll - Paque 플러스를 사용하여 밀도 원심 분리로 구분됩니다. Ficoll - Paque 플러스의 underlayment는 플러스 천천히 두 레이어를 혼합하지 않도록주의되는 세포 현탁액 아래 Ficoll - Paque 15 ML을 pipeting에 의해 생성됩니다.
- 세포 현탁액과 Ficoll 레이어는 브레이크와 함께 30 분 동안 500x g에 centrifuged집니다 것은 해제.
- Ficoll - Paque 플러스 및 세포 분리 버퍼의 인터페이스에서 전지 수집 신선한 50 ML 원뿔 튜브로 전송됩니다.
- 신선한 DMEM 10 % FCS와 함께 보충 것은 그것을 희석하기 위해 세포 현탁액에 추가됩니다 1시 3분 (예 : 20 ML 신선한 미디어 세포 현탁액의 10 ML에 추가).
- 세포는 10 분 decanted 미디어 450x g에서 원심 분리하여 수집하고 있으며, 세포 펠렛은 ALDEFLUOR 버퍼 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 세포 현탁액의 열 microliters 10 μL trypan 파랑, 가능한 세포를 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다와 희석 수 있습니다. 죽은 세포 또는 조직 파편 많은이 단계에서 언급하는 경우에는 다음 밀도 원심 분리하여 세포 분리는 (- 3.7 단계 3.3) 반복 수 있습니다.
4. 형광 활성 세포 정렬에 대한 세포를 얼룩
- 로 분류 일곱 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브는 다음과 같습니다
- 흠없는
- CD44 - APC
- CD24 - PE
- 마우스 CD31 - 비오틴 + 마우스 혈통 - 비오틴 + 마우스 H - 2Kd - 비오틴
- ALDEFLUOR
- ALDEFLUOR + DEAB + IgG 2bκ - APC + IgG 2aκ - PE
- ALDEFLUOR + CD44 - APC + CD24 - PE + 마우스 CD31 - 비오틴 + 마우스 혈통 - 비오틴 + 마우스 H - 2Kd - 비오틴.
- 만 5-10 셀 / ML의 최종 농도 ALDEFLUOR 버퍼 2 ML에 세포 현탁액을 희석하여 얼음 계속. 튜브 # 1, 2, 3, 4에 세포 현탁액을 100 μL를 추가하고 얼음에 있습니다. 튜브 # 6-1 μL DEAB를 추가하고 얼음 계속. 1000 희석 나머지 세포 현탁액에 ALDEFLUOR 시약 추가 - 접어 (예 : 1.6 ML의 세포 현탁액을 1.6 μL ALDEFLUOR 시약 추가) 잘 혼합하고, 얼음에 놓으십시오. 튜브 # 7-100 튜브 # 5와 6이 혼합물 μL, 나머지 혼합물 (1.4 ML)를 전송합니다. 40 분 37 ° C 물 목욕에있는 튜브를 모두 품어. 튜브의 바닥에 정착에서 세포를 방지하기 위해 세포 현탁액마다 10 분 정도 섞는다.
- 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 100 μL ALDEFLUOR 버퍼에 튜브 # 1 5 알약을 Resuspend. 튜브 # 2, 3, 4, 6하려면 다음과 같이 희석 적절한 항체를 포함하는 ALDEFLUOR 버퍼 100 μL를 추가 : IgG 2bΚ - APC, IgG 2aΚ - PE, CD44 - APC, 그리고 CD24 - PE에 대한 1시 20분항체, 마우스 CD31 - 비오틴에 대한 1:100, 마우스 혈통 - 비오틴, 마우스 H - 2Kd - 비오틴 항체. 튜브 위해 # 7은 1.4 CD44 - APC의 1시 20분 희석을 포함 ALDEFLUOR 버퍼의 ML, 그리고 CD24 - PE 항체와 마우스의 1:100 희석 CD31 - 비오틴을 추가, 마우스 혈통 - 비오틴, 마우스 H - 2Kd - 비오틴 항체. 10 분 얼음 셀 suspensions을 품어.
- 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 튜브 # 1, 2 산탄, 3, 5, 100 μL ALDEFLUOR 버퍼에서 6 Resuspend. streptavidin - PerCP 단백질의 1:100 희석을 포함 ALDEFLUOR 버퍼의 1.5 ML를 준비합니다. 튜브 # 4-100 μL를 추가하고 튜브 # 7-1.4 ML를 추가합니다. 10 분 얼음 셀 suspensions을 품어.
- 450x g에서 세포와 4 원심 분리기 ° C 10 분, 다음 버퍼를 가만히 따르다하십시오. 튜브 # 1, 2 산탄, 3, 4, 5, 200 μL ALDEFLUOR 버퍼에서 6 Resuspend. 2 μg / ML의 propidium 요오드화물을 포함하는 제품 ALDEFLUOR 버퍼의 2.8 ML에 튜브 # 7 펠렛을 Resuspend. 항상 얼음에 튜브 보관하십시오.
- 스트레이너 모자 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 35 μm의 필터를 통해 세포를 전달합니다.
5. 형광 활성 세포별로 정렬 암 줄기 세포를 분리
- FACSAria 흐름 cytometer은 세포 분류를위한 준비가되어 있습니다.
- 보정 컨트롤 튜브 # 1, 2, 3, 4, 5의 세포를 사용하여 설정됩니다.
- 게이츠는 셀 singlets를 수집 전달 및 사이드 산란 매개 변수를 기반으로 만들어집니다.
- 비 마우스 (PerCP - 음수)과 가능한 (비 propidium 요오드화물 얼룩) 세포는 FL - 3 채널을 사용하여 문이 있습니다.
- DEAB - 대우 전지 (튜브 # 6) 및 FL - 1 채널을 사용하여 만든 ALDH + 세포는 게이츠에 따라 수집하고 있습니다.
- CD44 + CD24 + 세포는 게이츠에 따라 수집하는 FL - 4 및 FL - 2 채널을 사용 ALDEFLUOR, IgG 2bΚ - APC 및 IgG 2aκ - PE (튜브 # 6) 물들일 세포를 사용하여 만들었습니다.
- 세포 10% FCS와 보충 DMEM 1 ML을 포함 12 X 75mm의 폴리스티렌 테스트 튜브에 수집하고 있습니다.
- 세포가 정렬되고 나면, 가만히 따르다 10 분 미디어 450x g에 세포 현탁액을 원심 분리기, 500 μL 신선한 DMEM에있는 세포를 resuspend 10% FCS와 함께 보충.
- 로 단계 3.8에 설명된 hemocytometer를 사용하여 정렬 세포의 수를 계산합니다.
6. 대표 결과
이 프로토콜은 ALDH + 및 CD44 + CD24 + 췌장 CSCs의 고립으로 이어질 것입니다. 마우스 파생 세포의 비율이 변수이지만, 우리는 대부분의 인간의 췌장 암 xenografts가 마우스 CD31을 사용하여 마우스 유래 세포, 마우스 가계 칵테일, 마우스 H - 2Kd 비오틴 - 복합 항체 (그림 1A 20-60 %를 포함하는 것으로 나타났습니다 ). 마찬가지로 다른 xenografts에서 각 CSC 인구의 빈도가 변수이지만, 일반적으로 우리는 전체 세포 인구 1-4 %가 ALDH + (그림 1B)이며 0.2-5 %가 CD44 + CD24 + (그림 1C) 것으로 나타났습니다.
FACSAria 기계 카운트가 자주 인해 FACSAria 감지되지 않은 세포 입자에 정확 있기 때문에 우리는 정기적으로 수동으로 hemocytometer를 사용하여 정렬 셀을 계산합니다.
그림 1. 유동세포계측법의 줄거리는 췌장암의 이종 이식에서 특정 인구를 묘사. (A) FL - 3 채널에 적극적으로 얼룩 세포 (propidium 요오드화물은 +, 마우스 CD31 + 마우스 가계 +, 또는 마우스 H - 2Kd +)가 단 분리만큼 제외됩니다 가능한이 아닌 마우스 세포를 파생. (B) 인간의 췌장암의 이종 이식의 ALDH 활동은 ALDH1 억제제 diethylamino - benzaldehyde (DEAB)의 존재와 부재의 ALDEFLUOR 시약을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정되었다. 프레임 DEAB로 치료 세포를 기반으로 만든 후 세포 치료에 적용되었다 ALDH + 세포를 묘사 문을 나타냅니다. ALDH의 + 세포의 비율은 게이트에 표시됩니다. (C) CD44 + CD24 + 문이 ALDEFLUOR 물들일 세포를 기반으로 작성하고, IgG 2bκ - APC (CD44 - APC에 대한 isotypic 제어)과 IgG 2aκ - PE는 (CD24 - PE에 대한 isotypic 제어) 항체되었습니다. CD44 + CD24 + 세포의 비율은 게이트에 표시됩니다.
Discussion
이 프로토콜은 인간 xenografts에서 췌장 CSCs의 고립을 설명합니다. 이 절차의 몇 가지 주요 단계는 가능한 CSCs의 수율을 향상시킬 것입니다. 췌장 CSCs의 순수한 인구의 복구 FACSAria에 정렬하기 전에 세포 현탁액에있는 가능한 세포의 순도에 따라 달라집니다. 최대 지름 1 cm 미만 xenografts를 사용 돌보는 것은 종양의 중심부에 괴사 조직의 양을 줄이는 데 도움이됩니다. 또한 Ficoll - Paque 기울기 원심 분리하는 동안 조직 파편과 죽은 세포의 세포 현탁액을 파괴하는 것은 중요하고 세포가 hemocytometer를 계산하는 경우 조직 파편이나 비 가능한 세포의 많은 수의가 감지하는 경우 반복 수 있습니다.
얼룩 프로토콜 여기에 특정 세포 표면 항원을 감지하는 ALDH 활동뿐만 아니라 형광단 - 복합 항체를 감지 ALDEFLUOR 시약 시스템을 활용하여 설명했다. ALDEFLUOR의 얼룩은 37 ° C 수행하고, 따라서 항체 얼룩이 (얼음) 37에서 일어날 수있는 항체가 상한의 가능성, ° C.을 방지하기 전에 완료해야합니다 세포 ALDEFLUOR 시약을 유출 수 있기 때문에 4 ALDEFLUOR 버퍼에있는 세포를 유지하는 것이 중요합니다 ° ALDEFLUOR의 얼룩 후 C가 완료되었습니다. ALDEFLUOR 버퍼는 ALDEFLUOR의 세포내 수준을 유지하는 데 도움이 약물 유출 억제제가 포함되어 있습니다.
이 방법은 가능한 췌장 CSCs를 분리 이후 그들은 이러한 세포의 생리 기능을 측정하는 실험의 숫자 적용할 수 있습니다. 우리는 immunocompromised 쥐 및 체외 세포 마이 그 레이션 / 침공 assays를 이용한 종양 - 개시 assays 이러한 세포를 사용했습니다. 또한, RNA, DNA, 그리고 단백질은 CSC 및 비 - CSC의 인구를 비교 분석 연구에 대해 이러한 세포에서 수집한 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 WM으로 국립 보건원에서 보조금 (CA127574, CA107040 및 CA09071)에서 지원이
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Fetal calf serum | Harlan Laboratories | BT-9501 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | |
| 100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| 70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | |
| 50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
| ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies | 01700 | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| 12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | |
| CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | |
| Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | |
| Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec | 130-092-613 | |
| Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | |
| IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | |
| IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | |
| Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |
References
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