El aislamiento de células madre de cáncer de páncreas xenoinjertos

Summary

Las células madre del cáncer (CCC) se han identificado en un número de tumores malignos. En este protocolo se describe un método de citometría de flujo utilizando la actividad de aldehído deshidrogenasa y la expresión de CD44 y CD24 para aislar células madre cancerosas de xenoinjertos de adenocarcinoma pancreático. Estas células viables se pueden utilizar en los estudios funcionales y análisis.

Abstract

Las células madre del cáncer (CCC) se han identificado en un número cada vez mayor de enfermedades malignas y son funcionalmente definido por su capacidad para someterse a la auto-renovación y producir ^una progenie diferenciada. Estas propiedades permiten CSC para recapitular el tumor original cuando se inyectan en ratones inmunodeficientes. CSC dentro de un tumor maligno del epitelio fueron descritos por primera vez en el cáncer de mama y se encontró para mostrar la superficie específica de expresión de células antígeno (CD44 ⁺ CD24 ^{baja / -) 2.} Desde entonces, el CSC se han identificado en un número creciente de otras neoplasias humanas con CD44 y CD24, así como una serie de antígenos de superficie. Propiedades fisiológicas, incluyendo la aldehído deshidrogenasa (ALDH) la actividad, también se han utilizado para aislar células madre cancerosas en los tejidos malignos ^3-5.

Recientemente, y otros han identificado células madre cancerosas del adenocarcinoma de páncreas sobre la base de la actividad de la ALDH y la expresión de los antígenos de superficie celular CD44 y CD24, CD133 y ^6-8. Estas poblaciones altamente tumorigénico pueden o no pueden superponerse y mostrar otras funciones. Hemos encontrado que ALDH ⁺ y CD44 ⁺ CD24 ⁺ páncreas CSC son igualmente tumorigénico, pero las células ALDH ⁺ son relativamente más invasiva ^8. En este protocolo se describe un método para aislar células madre cancerosas del páncreas viable de xenoinjertos de bajo tránsito humano ^9. Tumores transplantados son cosechados de los ratones y se convierte en una suspensión de una sola célula. Restos de tejido y las células muertas se separan de las células vivas y luego se tiñen con anticuerpos contra CD44 y CD24 y usando el reactivo ALDEFLUOR, un sustrato fluorescente de ALDH ^10. CSC se aíslan por clasificación celular activado por fluorescencia. Aislado células madre cancerosas puede ser usado para los ensayos analíticos o funcionales que requieren las células viables.

Protocol

1. Xenoinjertos de la cosecha de los ratones

1. Prepare la disociación celular de amortiguación: Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS), penicilina-estreptomicina, 200 U / ml de colagenasa tipo IV, y el 0,6 dispasa U / mL.
2. Un atímicos (nu + / nu +) ratón albergar una inyección subcutánea humanos xenoinjertos de cáncer de páncreas que es menos de 1 cm de diámetro mayor es la eutanasia por asfixia de dióxido de carbono y la dislocación cervical.
3. El tumor se extrae por vía subcutánea en el flanco del ratón mediante disección roma con unas pinzas y tijeras y se coloca inmediatamente en el buffer de disociación celular.
4. Los tumores se pesan y se coloca de nuevo en 10 ml de células buffer de disociación por 1 gramo de tejido del tumor.

2. Generar una única suspensión de células a partir de los xenoinjertos

1. Trabajo en un recipiente estéril de cabinas de seguridad, el tumor se transfiere a un 100 x 20 mm placa de cultivo con 1 ml de células buffer de disociación. Los tumores son mecánicamente picada con cuchillas de afeitar y pinzas estériles. La suspensión de las células tumorales se tritura a través de una pipeta serológica de 5 ml de 10 veces. Las piezas del tumor debe ser lo suficientemente pequeño como para no obstruir la pipeta serológica de 5 ml.
2. La suspensión de las células tumorales se transfiere a un tubo cónico de 50 ml que contiene el volumen restante de disociación celular de amortiguación (llena de menos del 50%) y vortex a máxima velocidad durante 1 minuto.
3. La suspensión de las células tumorales se incuba a 37 ° C durante 2 horas con agitación intermitente durante 1 minuto cada 20 minutos.

3. Agotan la suspensión de células de restos de tejido y las células muertas

1. Después de la incubación de 2 horas la suspensión celular se agita a la máxima velocidad durante 1 minuto.
2. La suspensión celular se hace pasar por un filtro de 70 micras, y se recoge en un nuevo máximo de 50 ml tubo cónico y ajustado a un volumen final de 15 ml por tubo.
3. A fin de separar las células viables de las células muertas y restos de tejido, la suspensión de las células tumorales se separa por centrifugación de densidad con Ficoll-Paque Plus. Una capa de base de Ficoll-Paque Plus es creado por pipeta 15 ml de Ficoll-Paque Plus lentamente por debajo de la suspensión celular con cuidado de no mezclar las dos capas.
4. La suspensión de células y capas de Ficoll se se centrifuga a 500x g durante 30 minutos con el freno desactivado.
5. Las células en la interfase del Plus Ficoll-Paque y el tampón disociación celular se recogen y se transfieren a un nuevo máximo de 50 ml tubo cónico.
6. DMEM suplementado con 10% FCS, se añade a la suspensión celular para diluirla 1:3 (por ejemplo, 20 ml de medio fresco a 10 ml de suspensión celular).
7. Las células se recogieron por centrifugación a 450x g durante 10 minutos, los medios de decantación y el pellet de células se resuspende en 1 ml de solución tampón ALDEFLUOR.
8. Diez microlitros de la suspensión celular se diluye con 10 l azul tripano y las células viables se contaron usando un hemocitómetro. Si un gran número de células muertas o restos de tejido se observó durante este paso, entonces la separación de células por centrifugación de densidad se puede repetir (pasos 3,3 hasta 3,7).

4. Tinción de las células de clasificación celular activado por fluorescencia

1. Etiqueta de siete de 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno de la siguiente manera:
   1. Sin mancha
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. ratón CD31-biotina + ratón linaje-biotina + ratón H-biotina-2Kd
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + + IgG DEAB _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + ratón + CD31-biotina ratón linaje-biotina + ratón H-2Kd-biotina.
2. Diluir la suspensión de células en 2 ml de solución tampón ALDEFLUOR a una concentración final de 5-10 millones de células / ml y mantener en hielo. Añadir 100 ml de la suspensión celular a los tubos 1, 2, 3 y 4 y mantener en hielo. Añadir un DEAB l de tubo n º 6 y mantener en hielo. Añadir el reactivo ALDEFLUOR a la suspensión celular diluida restante 1000 - veces (por ejemplo, añadir 1,6 l de reactivo ALDEFLUOR a 1,6 ml de suspensión celular), mezclar bien y colocar en hielo. Transferencia de 100 l de esta mezcla en los tubos # 5 y 6, y el resto de la mezcla (1,4 ml) al tubo # 7. Incubar todos los tubos en un baño de agua 37 ° C durante 40 minutos. Mezcle la suspensión de células cada 10 minutos con el fin de evitar que las células se depositen en el fondo de los tubos.
3. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1 y 5 de cada 100 l de amortiguación ALDEFLUOR. A los tubos # 2, 3, 4 y 6, añadir 100 ml de solución tampón ALDEFLUOR que contiene los anticuerpos adecuados diluido de la siguiente manera: 1:20 de la IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, y CD24-PEanticuerpos; 1:100 para el ratón CD31-biotina, el ratón linaje-biotina, y el ratón H-biotina-2Kd anticuerpos. Al tubo # 7 añadir 1,4 ml de solución tampón que contiene ALDEFLUOR una dilución 1:20 de CD44-APC, y los anticuerpos CD24-PE y una dilución de 1:100 de ratón CD31-biotina, el ratón linaje-biotina, y el ratón H-biotina-2Kd anticuerpos. Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 minutos.
4. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1, 2, 3, 5 y 6 de cada 100 l de amortiguación ALDEFLUOR. Preparar 1.5 mL de tampón ALDEFLUOR que contiene una dilución 1:100 de estreptavidina-PerCP proteínas. Añadir 100 ml de tubo n º 4 y añadir 1,4 ml al tubo # 7. Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 minutos.
5. Centrifugar las células a 450x g y 4 ° C durante 10 minutos y luego decantar el buffer. Volver a suspender las pastillas en tubos de 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de cada 200 l de amortiguación ALDEFLUOR. Resuspender el precipitado en el tubo # 7 en 2,8 ml de solución tampón que contiene ALDEFLUOR 2 mg / ml de yoduro de propidio. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.
6. Pasar las células a través de 35 micras filtro con 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno con tapas de filtro.

5. Aislar células madre del cáncer de clasificación celular activado por fluorescencia

1. Un citómetro de flujo FACSAria se prepara para la clasificación de la célula.
2. Controles de compensación se establecen con las células de los tubos 1, 2, 3, 4 y 5.
3. Gates se crean sobre la base de proyecciones y los parámetros de dispersión lateral para recoger células de tirantes.
4. No-ratón (PerCP-negativo) y células viables (no teñidas de propidio yoduro) son cerradas mediante el canal FL-3.
5. ALDH ⁺ células se obtienen sobre la base de las puertas creadas con DEAB las células tratadas (tubo n º 6) y el canal FL-1.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ células se obtienen sobre la base de las puertas creadas con células teñidas con ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, y la IgG _2aκ-PE (tubo n º 6) con el FL-4 y los canales de FL-2.
7. Las células se recolectan en 12 x 75 mm tubos de ensayo de poliestireno que contiene 1 ml de DMEM suplementado con 10% FCS.
8. Después las células han sido ordenados, centrifugar la suspensión celular a 450x g durante 10 minutos, decantar los medios de comunicación, y volver a suspender las células en 500 l DMEM suplementado con 10% FCS.
9. Cuente el número de células seleccionadas utilizando un hemocitómetro como se describe en el paso 3.8.

6. Resultados representante

Este protocolo conducirá al aislamiento de ALDH ⁺ y CD44 ⁺ CD24 ⁺ de páncreas células madre cancerosas. El porcentaje de células derivadas de ratón es variable, pero hemos encontrado que la mayoría de los xenoinjertos de cáncer humano de páncreas contienen un 20-60% de las células derivadas de ratón con el ratón CD31, cóctel de ratón linaje, y el ratón H-biotina 2Kd anticuerpos conjugados (Figura 1 ). Asimismo, la frecuencia de cada población CSC de xenoinjertos diferentes es variable, pero en general hemos encontrado que 4.1% de la población total de células ALDH es ⁺ (fig. 1B) y 0,2-5% es CD44 ⁺ CD24 ⁺ (fig. 1C).

En forma rutinaria manual recuento de células ordenados utilizando un hemocitómetro desde la máquina cuenta FACSAria son a menudo inexactas debido a la no-celular partículas detectadas por el FACSAria.

Figura 1. Trama de citometría de flujo que representa la población específica de un xenoinjerto de cáncer de páncreas. (A) Las células de tinción positiva en el canal FL-3 (yoduro de propidio ^+, CD31 ⁺ ratón ⁺ linaje de ratón o mouse H-2Kd ⁺⁾ están excluidos a fin de aislar sólo viables y no las células derivadas de ratones. (B) la actividad de la ALDH en un xenoinjerto de cáncer de páncreas humanos se midió por citometría de flujo utilizando el reactivo ALDEFLUOR en presencia y ausencia del inhibidor ALDH1 dietilamino-benzaldehído (DEAB). Los cuadros representan las puertas que representan las células ALDH ⁺ que se han creado sobre la base de las células tratadas con DEAB y luego se aplican a las células no tratadas. Los porcentajes de células ⁺ ALDH se muestran en la puerta. (C) El CD44 ⁺ CD24 ⁺ puerta fue creado a partir de células teñidas con ALDEFLUOR, y los anticuerpos IgG _2bκ-APC (control isotípico de CD44-APC) y la IgG _2aκ-PE (control isotípico de CD24-PE). Los porcentajes de células CD44 ⁺ CD24 ⁺ se muestran en la puerta.

Discussion

Este protocolo describe el aislamiento de células madre cancerosas del páncreas de xenoinjertos humanos. Varios pasos clave en este procedimiento mejorará el rendimiento de los viables CSC. La recuperación de una población pura de células madre cancerosas del páncreas depende de la pureza de las células viables presentes en la suspensión celular antes de la clasificación en el FACSAria. Asegurándose de que utilizan los xenoinjertos de menos de 1 cm de diámetro mayor ayuda a reducir la cantidad de tejido necrótico en el centro del tumor. Además, el agotamiento de la suspensión de células de restos de tejido y las células muertas durante la centrifugación en gradiente de Ficoll-Paque es crítica y puede repetirse si un gran número de restos de tejido o células no viables se detectan cuando las células se contó con el hemocitómetro.

El protocolo de tinción descrito aquí utiliza el sistema de reactivos para detectar la actividad ALDEFLUOR ALDH, así como los anticuerpos conjugados con fluorocromo para detectar antígenos específicos de la superficie celular. Tinción ALDEFLUOR se realiza a 37 ° C y, por tanto, debe ser completado antes de la tinción de anticuerpos (sobre hielo) para evitar la posibilidad de limitación de anticuerpos, lo que puede ocurrir a 37 º C. Dado que las células pueden eflujo reactivo ALDEFLUOR, es importante para mantener las células en ALDEFLUOR buffer a 4 ° C después de la tinción ALDEFLUOR se ha completado. El buffer ALDEFLUOR contiene un inhibidor de flujo de salida de la droga que ayuda a mantener los niveles intracelulares de ALDEFLUOR.

Dado que este método aísla viable páncreas CSC se pueden aplicar en una serie de experimentos que miden la función fisiológica de estas células. Hemos utilizado estas células para los ensayos de la iniciación del tumor, la utilización de ratones inmunodeprimidos y en ensayos de células in vitro de migración / invasión. Además, el ARN, el ADN y las proteínas se pueden obtener de estas células para la comparación de los estudios analíticos CSC y las poblaciones no-CSC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235