Isolering av stamceller från mänskliga xenografter Pankreascancer

Summary

Cancer stamceller (CSCs) har identifierats i ett flertal maligniteter. I detta protokoll beskriver vi en flödescytometrisk metod att utnyttja aktivitet aldehyddehydrogenas och CD44 och CD24 uttryck för att isolera CSCs från mänsklig xenografter pankreas adenocarcinom. Dessa livsdugliga celler kan sedan användas i funktionella och analytiska studier.

Abstract

Cancer stamceller (CSCs) har identifierats i ett växande antal maligniteter och är funktionellt definieras genom sin förmåga att genomgå självförnyelse och producera differentierade avkomma ^1. Dessa egenskaper gör CSCs sammanfatta den ursprungliga tumören när det injiceras i nedsatt immunförsvar möss. CSCs inom en epiteliala maligniteter var första beskrivs i bröstcancer och funnit att visa specifik cell uttryck ytantigen (CD44 ⁺ CD24 ^{låg / -) 2.} Sedan dess har CSCs har identifierats i ett ökande antal andra mänskliga maligniteter med CD44 och CD24 samt ett antal andra ytantigener. Fysiologiska egenskaper, inklusive aldehyd dehydrogenas (ALDH) verksamhet har också använts för att isolera CSCs från maligna vävnader ^3-5.

Nyligen identifierade vi och andra CSCs från pankreas adenocarcinom baserat på ALDH verksamhet och uttryck av antigenerna cellytan CD44 och CD24 och CD133 ^6-8. Dessa mycket tumörframkallande populationer kan eller inte kan vara överlappande och visa andra funktioner. Vi fann att ALDH ⁺ och CD44 ⁺ CD24 ⁺ bukspottkörteln CSCs är lika tumörframkallande, men ALDH ⁺ celler är relativt mer invasiv ^8. I detta protokoll beskriver vi en metod att isolera livskraftiga bukspottkörteln CSCs från låg-passage mänskliga xenografter ^9. Xenografted tumörer skördas från möss och göras till en encelliga suspension. Tissue skräp och döda celler avskiljs från levande celler och sedan färgas med hjälp av antikroppar mot CD44 och CD24 och använda ALDEFLUOR reagens, en fluorescerande substrat för ALDH ^10. CSCs sedan isoleras med fluorescens aktiverad cell sortering. Isolerade CSCs kan sedan användas för analytiska och funktionella analysmetoder kräver livskraftiga celler.

Protocol

1. Harvest xenografter från möss

1. Förbered cellen dissociation buffert: Dulbecco ändrade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), penicillin-streptomycin, 200 U / mL kollagenas typ IV och 0,6 U / mL dispase.
2. En athymic (NU + / Nu +) mus hyser en subkutan mänskliga xenograft pankreascancer som är mindre än 1 cm i största diameter avlivas med koldioxid kvävning och halsdislokation.
3. Den subkutana Tumören är skördats från flanken av musen genom dissektion med hjälp av pincett och sax och placeras omedelbart i cellen dissociation buffert.
4. Tumörer vägs och läggs tillbaka i 10 ml cell dissociation buffert per 1 gram tumörvävnad.

2. Generera en Single-cellsuspensionen från implanterad

1. Att arbeta i en steril biosäkerhet skåp är tumören överförs till en 100 x 20 mm kultur fat med 1 ml cell dissociation buffert. Tumörer är mekaniskt malet med sterilt rakblad och pincett. Tumören cellsuspension är grov-genom en 5-mL serologiska pipett 10 gånger. Tumören bitar bör vara tillräckligt liten för att inte täppa till 5-mL serologiska pipett.
2. Tumören cellsuspension överförs till en 50 ml E-röret med den kvarvarande volymen av cell dissociation buffert (fylld mindre än 50%) och vortexed med maximal hastighet under 1 minut.
3. Tumören cellsuspension sedan inkuberas vid 37 ° C i 2 timmar med intermittent vortexa under 1 minut per 20 minuter.

3. Bryter cellsuspension av Tissue skräp och döda celler

1. Efter två timmars inkubation cellsuspensionen är vortexed med högsta hastighet under 1 minut.
2. Cellsuspensionen leds sedan genom ett 70-ìm filter och samlas upp i en ny 50-ml koniska rör och justeras till en slutlig volym på 15 ml per rör.
3. För att ytterligare skilja livskraftiga celler från döda celler och vävnader skräp, är tumören cellsuspension separerade med densitet centrifugering med Ficoll-Paque Plus. En underlayment av Ficoll-Paque Plus är skapad av pipeting 15 mL Ficoll-Paque Plus långsamt under cellsuspensionen försiktigt så att inte blanda de två lagren.
4. Cellsuspensionen och lager Ficoll är centrifugeras vid 500x g under 30 minuter med bromsarna avstängd.
5. Celler i gränssnittet för Ficoll-Paque Plus och cell dissociation buffert samlas in och överförs till en ny 50-ml konisk tub.
6. Färska DMEM kompletteras med 10% FCS läggs till cellsuspension att späda ut det 1:3 (t.ex. 20 ml färsk medier tillsätts 10 ml cellsuspension).
7. Cellerna samlas in genom centrifugering vid 450x g under 10 minuter, det dekanterade media och cellpellet suspenderade i 1 ml ALDEFLUOR buffert.
8. Tio mikroliter av cellsuspensionen späds med 10 mikroliter trypan blå och livskraftiga celler räknas med hjälp av en hemocytometer. Om ett stort antal döda celler eller vävnader skräp konstateras under detta steg, sedan cellseparation av densiteten centrifugering kan upprepas (steg från 3,3 till 3,7).

4. Färga celler för Fluorescens aktiverat cellsorterings

1. Etikett sju 12 x 75 mm frigolit provrör enligt följande:
   1. Obehandlat
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. mus CD31-biotin + mus härstamning-biotin + mus H-2Kd-biotin
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44-APC + CD24-PE + mus CD31-biotin + mus härstamning-biotin + mus H-2Kd-biotin.
2. Späd cellsuspensionen i 2 ml ALDEFLUOR buffert till en slutlig koncentration på 5-10 miljoner celler / ml och hålla på is. Tillsätt 100 mikroliter av cellsuspensionen att rören # 1, 2, 3 och 4 och hålla dem på is. Tillsätt 1 mikroliter DEAB till röret # 6 och håller på is. Lägg ALDEFLUOR reagens till de återstående cellsuspension utspädd 1000 - faldigt (t.ex. lägga till 1,6 mikroliter ALDEFLUOR reagens till 1,6 ml cellsuspension), blanda väl och lägg på is. Överföring 100 mikroliter av denna blandning för att rören # 5 och 6, och resterande blandningen (1,4 ml) för att tub # 7. Inkubera alla rör i ett 37 ° C vattenbad i 40 minuter. Blanda cellsuspension var 10 minuter för att förhindra cellerna från att landa på botten av rören.
3. Centrifugera cellerna vid 450x g och 4 ° C i 10 minuter och sedan dekantera bufferten. Resuspendera pellets i rören # 1 och 5 i 100 mikroliter ALDEFLUOR buffert. För att rören # 2, 3, 4 och 6, tillsätt 100 ìl ALDEFLUOR buffert som innehåller lämpliga antikroppar spädas enligt följande: 1:20 för IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, och CD24-PEantikroppar, 1:100 för mus CD31-biotin, mus härstamning-biotin och mus H-2Kd-biotin antikroppar. För att röret # 7 lägga 1,4 mL ALDEFLUOR buffert som innehåller en 1:20 spädning av CD44-APC, och CD24-PE antikroppar och en 1:100 utspädning av mus-CD31-biotin, mus härstamning-biotin och mus H-2Kd-biotin antikroppar. Inkubera cellsuspensioner på is i 10 minuter.
4. Centrifugera cellerna vid 450x g och 4 ° C i 10 minuter och sedan dekantera bufferten. Resuspendera pellets i rören # 1, 2, 3, 5 och 6 i 100 mikroliter ALDEFLUOR buffert. Förbered 1,5 mL ALDEFLUOR buffert som innehåller en 1:100 utspädning av streptavidin-PerCP protein. Tillsätt 100 mikroliter till röret # 4 och lägga till 1,4 ml till rör # 7. Inkubera cellsuspensioner på is i 10 minuter.
5. Centrifugera cellerna vid 450x g och 4 ° C i 10 minuter och sedan dekantera bufferten. Resuspendera pellets i rören # 1, 2, 3, 4, 5 och 6 i 200 mikroliter ALDEFLUOR buffert. Återsuspendera pelleten i röret # 7 i 2,8 ml ALDEFLUOR buffert som innehåller 2 mikrogram / ml propidiumjodid. Håll rören på is hela tiden.
6. Pass celler genom 35-ìm filtret med 12 x 75 mm rör polystyren testa med sil mössor.

5. Isolera cancer stamceller genom fluorescens Aktiverat cellsorterings

1. En FACSAria flödescytometer är förberedd för cell sortering.
2. Ersättning kontroller ställs in med celler från rören # 1, 2, 3, 4 och 5.
3. Gates skapas baserade på framåt-och biverkningar scatter parametrar för att samla in cell undertröjor.
4. Icke-mus (PerCP-negativa) och livskraftiga (icke-propidiumjodid färgade) celler är gated använder FL-3-kanal.
5. ALDH ⁺ celler samlas bygger på grindar skapas med hjälp av DEAB-behandlade celler (tub # 6) och FL-1-kanal.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ celler samlas bygger på grindar skapas med hjälp av cellerna färgas med ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, och IgG _2aκ-PE (rör # 6) med FL-4 och FL-2 kanaler.
7. Celler är samlade i 12 x 75 tester mm polystyren rör innehållande 1 mL DMEM kompletteras med 10% FCS.
8. Efter celler har sorterats, centrifugera cellsuspension på 450x g under 10 minuter och häll över media och resuspendera cellerna i 500 mikroliter färska DMEM kompletteras med 10% FCS.
9. Räkna antalet sorterade celler genom att använda en hemocytometer som beskrivs i steg 3,8.

6. Representativa resultat

Detta protokoll kommer att leda till isolering av ALDH ⁺ och CD44 ⁺ CD24 ⁺ bukspottkörteln CSCs. Andelen av mus-derived celler varierar, men vi har funnit att de flesta mänskliga bukspottkörtelcancer xenografter innehåller 20-60% mus-derived celler med musen CD31, mus härstamning cocktail och mus H-2Kd biotin-konjugerade antikroppar (Figur 1A ). Likaså frekvensen av varje CSC befolkningen från olika xenografter varierar, men generellt har vi funnit att 1-4% av den totala cellpopulation är ALDH ⁺ (Figur 1B) och 0,2-5% är CD44 ⁺ CD24 ⁺ (Figur 1C).

Vi rutinmässigt manuellt räknar sorteras celler med hjälp av en hemocytometer sedan FACSAria maskinen räknar ofta fel på grund av icke-cellulära partiklar upptäcks av FACSAria.

Figur 1. Flödescytometri tomt föreställer specifika populationer från en cancer i bukspottkörteln xenograft. (A) Celler färgning positivt i FL-3-kanal (propidiumjodid ^+, mus CD31 ⁺ mus härstamning ^+, eller mus H-2Kd ⁺⁾ är uteslutna så att isolera enbart livskraftiga och icke-mus härledda celler. (B) ALDH aktivitet i ett mänskligt bukspottkörtelcancer xenograft mättes med flödescytometri med ALDEFLUOR reagens i närvaro och frånvaro av ALDH1 hämmare dietylamino-bensaldehyd (DEAB). Ramarna representerar grindar som skildrar ALDH ⁺ celler som skapats som baseras på celler som behandlats med DEAB och sedan tillämpas på obehandlade celler. Andelen ALDH ⁺ celler visas i porten. (C) CD44 ⁺ CD24 ⁺ grind skapades som baseras på celler färgas med ALDEFLUOR och IgG _2bκ-APC (isotypisk kontroll för CD44-APC) och IgG _2aκ-PE (isotypisk kontroll för CD24-PE) antikroppar. Andelen CD44 ⁺ CD24 ⁺ celler visas i porten.

Discussion

Detta protokoll beskriver isolering av bukspottkörtelns CSCs från mänsklig xenografter. Flera viktiga steg i detta förfarande kommer att öka avkastningen av livskraftiga CSCs. Återhämtningen av en ren population av bukspottskörteln CSCs är beroende av renheten livskraftiga celler som finns i cellsuspensionen före sortering på FACSAria. Ta hand att använda xenografter som är mindre än 1-cm vid störst diameter bidrar till att minska mängden nekrotisk vävnad i mitten av tumören. Dessutom bryter ned cellsuspensionen av vävnad skräp och döda celler under Ficoll-Paque gradient centrifugering är kritisk och kan upprepas vid ett stort antal av vävnad skräp eller icke-viabla celler upptäcks när cellerna räknas på hemocytometer.

Den färgningsprotokollet beskrivs här utnyttjar ALDEFLUOR reagens systemet för att upptäcka ALDH verksamhet samt fluoroforen-konjugerade antikroppar för att påvisa specifika antigener på cellytan. ALDEFLUOR färgning sker vid 37 ° C och därför måste slutföras innan antikroppar färgning (på is) för att förhindra risken för antikroppar tak, vilket kan ske vid 37 ° C. Eftersom celler kan utflödet av ALDEFLUOR reagens, är det viktigt att bibehålla cellerna i ALDEFLUOR buffert vid 4 ° C efter ALDEFLUOR färgning har slutförts. Den ALDEFLUOR bufferten innehåller en hämmare efflux som bidrar till att upprätthålla intracellulära nivåer av ALDEFLUOR.

Eftersom denna metod isolerar livskraftig bukspottskörteln CSCs de kan tillämpas i ett antal experiment som mäter den fysiologiska funktionen av dessa celler. Vi har använt dessa celler för tumör-initiering analyser använder immunsupprimerade möss och in vitro cell migration / invasion analyser. Dessutom kan RNA, DNA och protein samlas in från dessa celler för analytiska studier som jämför CSC och icke-CSC befolkningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235